白僵菌菌種的分離試驗研究

馮玉元

（玉溪市紅塔山自然保護區(qū)管護局，云南 玉溪 653100）

白僵菌（Beauveria bassiana）屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、絲孢科、白僵菌屬，可寄生于昆蟲綱15目149科521屬707種[1]。白僵菌的孢子與蟲體接觸后，在適宜溫度和濕度條件下，吸取水分膨脹萌發(fā)1～2根芽管，分泌溶幾丁質(zhì)酶，溶解昆蟲體表層幾丁質(zhì)進入蟲體內(nèi)，芽管生長成菌絲后，吸取蟲體內(nèi)水分和養(yǎng)分繼續(xù)生長，最后蟲體充滿菌絲而死亡，且死亡后的蟲體僵硬并發(fā)白。菌絲發(fā)育成分生孢子梗，穿過蟲體，產(chǎn)生分生孢子，向外飛揚，隨風(fēng)傳播，感染其它昆蟲，形成昆蟲流行病[2]。昆蟲被白僵菌吸取水分和養(yǎng)分致使生理代謝障礙、混亂而死亡，對人畜無毒無害無副作用，不污染環(huán)境。但在生產(chǎn)白僵菌過程中，菌種在培養(yǎng)基上多次人工轉(zhuǎn)接，易發(fā)生衰退和老化，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量低，影響防治效果。故本試驗采用4種方法分離白僵菌的菌種，以期篩選出可一次性獲得污染率低、成功率高、質(zhì)量好、數(shù)量多的白僵菌純菌種。

1 試驗材料及器材

試驗材料 7月到云南省玉溪市靈照山林間，采集白僵菌感染的思茅松毛蟲幼蟲的新鮮蟲體若干頭，作為白僵菌菌種的分離培養(yǎng)種源。

試驗器材 解剖刀、96%濃度酒精、升汞液、酒精燈、滴管、接種針、電子天平（精確到0.001g）、顯微鏡(15×40 倍)、高溫高壓滅菌鍋（126℃0.14MPa、一次可滅菌15 mm×150 mm試管4 000支）、無菌接種箱、試管15 mm×150 mm、培養(yǎng)皿100 mm、三角瓶250 mL、吸管、蛋白胨、葡萄糖、面粉、黃豆粉、普鈣、思茅松毛蟲幼蟲粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂、溫度計、電磁爐、鍋、空調(diào)、四川長征藥業(yè)公司國藥準(zhǔn)字H51023730硫酸鏈霉素注射液2 mL、0.5 g。

2 試驗方法

2.1 培養(yǎng)基的配制

選用本單位白僵菌生產(chǎn)車間多年實踐、生長優(yōu)良的培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，葡萄糖10g，面粉5g，黃豆粉5 g，普鈣1 g，思茅松毛蟲粉5 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，硫酸鎂 0.2 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL。攪勻，熬化，分裝試管容量的三分之一，加蓋豎放，分裝培養(yǎng)皿2 mm厚，加蓋平放。試管成捆包扎，培養(yǎng)皿層疊包扎，250 mL三角瓶裝100 mL蒸餾水加蓋，置于滅菌鍋中，126℃和0.14 MPa滅菌30 min，移至無菌接種箱內(nèi)，擺斜面長2/3試管，平放培養(yǎng)皿，紫外線消毒30 min，制成無菌斜面和平面培養(yǎng)基及無菌水。

2.2 菌種的分離方法

采用4種方法分離白僵菌的菌種，每種方法采用同一林間白僵菌感染的思茅松毛蟲幼蟲新鮮蟲體中部，統(tǒng)一使用上述培養(yǎng)基配方。4種方法分別接種培養(yǎng)皿平面100個，培養(yǎng)出菌絲后，將菌絲分離接種到試管的整個斜面，每種方法接種1 000支，其中500支加入1%鏈霉素液接種培養(yǎng)，二者進行污染率對比。

酒精火焰消毒白僵菌感染的蟲體分離菌種（方法1） 選取蟲體中部，在無菌接種箱內(nèi)，將其浸入96%乙醇中至濕潤，取出后，在酒精火焰上燒一下，用無菌刀解剖蟲體成小塊（大小1 mm為宜），取1小塊置于培養(yǎng)皿中部，20℃培養(yǎng)3天后，可見白色菌絲生長，5天后挑取潔白粗壯菌絲，轉(zhuǎn)接到試管整個斜面，培養(yǎng)10～15天，斜面長滿白色粉層即可作為菌種。

升汞液消毒白僵菌感染的蟲體分離菌種（方法2） 選取蟲體中部，在無菌接種箱內(nèi)，將其浸入70%乙醇中至濕潤，取出后，再浸入0.1%升汞液中2 min，無菌水中清洗，解剖成小塊（大小1 mm為宜），取1塊置于培養(yǎng)皿中部，20℃培養(yǎng)3天后，可見白色菌絲生長，5天后挑取潔白粗壯菌絲，轉(zhuǎn)接到試管整個斜面，培養(yǎng)10～15天，斜面長滿白色粉層即可作為菌種。

不消毒白僵菌感染的蟲體用孢子粉劃線分離菌種（方法3） 選取蟲體中部，在無菌接種箱內(nèi)，用無菌接種針沾取少量蟲體中部白僵菌孢子粉，在培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上劃線，20℃培養(yǎng)3天后，可見白色菌絲生長，5天后挑取潔白粗壯菌絲，轉(zhuǎn)接到試管整個斜面，培養(yǎng)10～15天，斜面長滿白色粉層即可作為菌種。

不消毒白僵菌感染的蟲體用孢子粉稀釋分離菌種（方法4） 選取蟲體中部，用無菌接種針沾取少量蟲體中部的白僵菌孢子粉，于100 mL無菌水中搖晃稀釋，制成蟲體浸泡液，并在培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上滴入若干滴，傾斜并旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使浸泡液均勻分布在平面，20℃培養(yǎng)3天后，生長出白色小圓點，5天生長成圓形菌落，當(dāng)直徑為5～10 mm時，挑取潔白粗壯菌絲，轉(zhuǎn)接到試管整個斜面，培養(yǎng)10～15天，斜面長滿白色粉層即可作為菌種。

2.3 鏈霉素對分離白僵菌的菌種作用試驗

硫酸鏈霉素注射液與無菌水按比例配制成1%鏈霉素液，加入3滴鏈霉素液于試管培養(yǎng)基面上，并使其均勻分布，挑取菌絲轉(zhuǎn)接到整個斜面，作為方法A，未加入鏈霉素的，作為方法B，進行污染率比較。

2.4 觀察與統(tǒng)計

培養(yǎng)皿接種后，每隔24 h觀察1次，連續(xù)觀察5天，記錄菌絲每天的生長情況（表1）。挑取培養(yǎng)皿中分離的菌絲，轉(zhuǎn)接到試管培養(yǎng)基斜面后，每隔24 h觀察1次，連續(xù)觀察15天,每天檢查試管污染數(shù)量，同時移除污染試管，并對污染試管數(shù)量進行累計，記錄菌種培養(yǎng)污染數(shù)量。

3 結(jié)果分析

3.1 培養(yǎng)結(jié)果分析

由不同方法分離并培養(yǎng)的白僵菌菌絲生長情況（表1）可知：方法1和2的菌絲生長以接種蟲體為中心，向四周生長蔓延，形成近圓形團狀結(jié)構(gòu)物；方法3的菌絲生長沿劃線軌跡，連續(xù)、斷續(xù)或點狀生長，形成條狀或點狀結(jié)構(gòu)物；方法4的菌絲生長以單個或多個圓點向四周擴大生長，生長成單個或多個分散的圓形菌落。每種方法接種100個培養(yǎng)皿，方法1中生長菌絲的有71個、方法2中有96個、方法3有53個、方法4有31個，但是不能確定白僵菌的純度。

4種方法分離白僵菌的起始種源為同一林間采集的白僵菌感染的思茅松毛蟲幼蟲，方法1、2、3不具備單個孢子分開獨立條件，接種的種源均為微生物群體，接種培養(yǎng)的產(chǎn)物為多個微生物的菌絲混和物。方法4由于水的稀釋作用，可以讓接種種源孢子在水中分開并獨立成為單個孢子，具備單個孢子獨立的條件，單個孢子生長成菌絲，形成菌落，無其雜菌，挑取菌絲轉(zhuǎn)接到試管斜面中培養(yǎng)，容易獲取到純菌種。

表1 不同方法分離并培養(yǎng)白僵菌的菌絲生長情況

3.2 分離結(jié)果分析

由挑取分離菌種菌絲培養(yǎng)污染數(shù)量統(tǒng)計（表2）可知：4種分離方法培養(yǎng)的菌種，雜菌污染率呈現(xiàn)出顯著差異。方法4A培養(yǎng)基中加入鏈霉素液最佳，雜菌污染率為24%，方法4B培養(yǎng)基中未加入鏈霉素液較好，雜菌污染率為35.2%；培養(yǎng)基中加入鏈霉素液后，培養(yǎng)菌種出現(xiàn)的污染率低，顯著提高了白僵菌的菌種質(zhì)量和數(shù)量。

白僵菌的種源中存在各種微生物，接種后在培養(yǎng)基上爭奪養(yǎng)分，競爭生長，對白僵菌生長產(chǎn)生抑制作用，造成污染。污染白僵菌的主要是細(xì)菌，色淡黃，呈膠粘狀物；其次是真菌，菌絲呈松散絲狀物，孢子呈粉狀物，還有毛霉、木霉和黑根霉，分生孢子均為黑色，黃曲霉分生孢子為黃色，青霉分生孢子為青色。培養(yǎng)基中加入鏈霉素液可有效降低細(xì)菌污染率，鏈霉素可抑制細(xì)菌生長，促進白僵菌快速生長，使其快速占據(jù)培養(yǎng)基，吸取養(yǎng)分和水分，致使細(xì)菌失去養(yǎng)分、水分和生長空間，從而有效降低細(xì)菌的污染率，顯著提高白僵菌的菌種質(zhì)量和數(shù)量。與未加入鏈霉素比較，可降低雜菌污染率10%以上。

表2 挑取菌絲分離菌種培養(yǎng)污染數(shù)量統(tǒng)計

4 討論

4種方法分離白僵菌的菌種，其中最好的方法是孢子粉稀釋分離菌種，其次是孢子粉劃線分離菌種，最差是酒精火焰消毒白僵菌感染的蟲體分離菌種和升汞液消毒白僵菌感染的蟲體分離菌種。孢子粉稀釋分離菌種，雜菌污染率為35.2%，可一次性分離到64%左右菌種；在培養(yǎng)基中加入鏈霉素，雜菌污染率為24%，可顯著降低雜菌污染率，一次性分離到76%左右菌種。在培養(yǎng)基中加入鏈霉素進行孢子粉稀釋分離菌種，為分離菌種的最佳方法。孢子粉劃線分離菌種，雜菌污染率為81.6%，一次性分離到20%左右菌種；在培養(yǎng)基中加入鏈霉素，雜菌污染率為71.2%，可顯著降低雜菌污染率，一次性分離到30%左右菌種。酒精火焰消毒白僵菌感染的蟲體分離菌種和升汞液消毒白僵菌感染的蟲體分離菌種，雜菌污染率高，不宜采用。

［1］ 李增智.中國蟲生真菌研究與應(yīng)用［M］.(第一卷)北京：學(xué)術(shù)期刊出版社,1988,241.

［2］ 陳華癸，樊慶笙.微生物學(xué)［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1985,275.