川芎提取物通過激活Nrf2通路對(duì)抗心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激損傷

汪剛+劉瑩+侯雪峰+柯仲成+封亮+賈曉斌

[摘要] 川芎是臨床常用于心腦血管疾病的一味中藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)川芎提取物具有良好的抗氧化活性。該文主要探討川芎提取物對(duì)大鼠心肌缺血損傷氧化應(yīng)激干預(yù)作用及可能的機(jī)制。采用皮下注射鹽酸異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌缺血損傷模型，記錄各組大鼠心臟指數(shù)，比色法檢測(cè)血清肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）的活性及血清中丙二醛（MDA）含量，同時(shí)光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化，Western blot法檢測(cè)心肌組織中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、醌氧化還原酶（NQO1）和血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，川芎提取物能顯著降低心臟指數(shù)和血清心肌酶CK，LDH，AST水平，提高血清SOD和T-AOC活性并降低MDA含量，改善缺血損傷后心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加心肌組織中Nrf2，NQO1，HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)。該研究表明川芎提取物對(duì)大鼠心肌缺血損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活Nrf2信號(hào)通路，增加心肌組織抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 川芎； 氧化應(yīng)激； 心肌缺血損傷； Nrf2信號(hào)通路

[Abstract] Ligusticum chuanxiong is one of the common traditional Chinese medicinal herbs for treating various cardiovascular and cerebrovascular diseases， and a number of previous studies have demonstrated that the extract of L. chuanxiong has strong antioxidative activity. This paper was mainly aimed to investigate the effects and possible mechanisms of L. chuanxiong extraction on oxidative stress induced by myocardial ischemia injury in rats. The rats were subcutaneously injected with isoprenaline hydrochloride to induce myocardial ischemia injury and treated for 2 weeks. Then the cardiac indexes of the rats were recorded. The concentration of malondialdehyde （MDA） and activities of serum creatine kinase （CK）， lactate dehydrogenase （LDH）， aspartate transaminase （AST）， superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity （T-AOC） were measured by colorimetry. Light microscope was used to observe the morphological changes of myocardium， and the protein expressions of nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2）， quinone oxidoreductase （NQO1） and hemeoxygenase-1 （HO-1） in cardiac tissue were evaluated by Western blot. The results showed that L. chuanxiong extraction could decrease cardiac indexes and the values of CK， LDH and AST in blood serum， increase activities of serum SOD and T-AOC， reduce serum MDA concentration， improve myocardium structure after ischemia injury， and up-regulate the protein expressions of Nrf2， NQO1 and HO-1 in cardiac tissue. These findings revealed that the cardioprotective effects of L. chuanxiong extraction may be related to inhibiting oxidative stress through the activation of Nrf2 signaling pathway.

[Key words] Ligusticum chuanxiong； oxidative stress； myocardial ischemia injury； Nrf2 signaling pathway

心肌缺血損傷是指由于心臟供血量減少和供養(yǎng)不足，從而導(dǎo)致心肌能量代謝異常，心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[1]。其發(fā)生機(jī)制可能與多種因素有關(guān)，具有多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明氧化應(yīng)激在心肌缺血性損傷性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的作用[2-3]，心肌缺血時(shí)伴隨有大量活性氧簇（ROS）產(chǎn)生和堆積，引發(fā)機(jī)體內(nèi)源性氧化應(yīng)激，心肌細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。一方面促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡和心肌組織壞死；另一方面造成細(xì)胞膜通透性和流動(dòng)性發(fā)生改變，導(dǎo)致胞內(nèi)大量心肌酶外漏，加重心肌缺血損傷[4-5]。因此，有效地干預(yù)內(nèi)源性氧化應(yīng)激是改善心肌缺血損傷和保護(hù)心肌組織的重要途徑。endprint

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，素有“行氣活血，祛風(fēng)止痛”之功效?，F(xiàn)代研究表明川芎具有較好的抗心肌缺血藥效，廣泛應(yīng)用于冠心病、心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的治療與預(yù)防[6-7]。近年來研究證實(shí)川芎及其有效成分具有顯著的抗氧化活性，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的羥基自由基、過氧化氫超氧自由基、氫自由基、過氧化亞硝基等活性氧簇都有一定的清除作用[8-10]，但其抗心肌缺血氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制目前尚不明確。故本研究建立大鼠心肌缺血模型，觀察不同川芎提取物預(yù)處理對(duì)心肌缺血損傷的影響，旨在探討川芎提取物通過其抗氧化應(yīng)激作用發(fā)揮心肌缺血損傷保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)SCXK（滬）2016-0125。所有大鼠均分籠，并飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件：溫度（25±1） ℃，相對(duì)濕度（45±5）%，光暗各12 h，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物與試劑 川芎（亳州市萬珍中藥飲片廠，批號(hào)1604109）；鹽酸地爾硫卓片（天津田邊制藥有限公司，批號(hào)1603019）；鹽酸異丙腎上腺素（Sigma，批號(hào)WXBC2200V）；水合氯醛（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)F20160116）；肌酸激酶（CK）試劑盒（批號(hào)20161012），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號(hào)20161012），天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（批號(hào)20161012），丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)20161023），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)20161023），總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（批號(hào)20161023）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Nrf2單克隆抗體，兔抗大鼠NQO1單克隆抗體，兔抗大鼠HO-1單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器 ECGV-6012心電圖機(jī)（深圳衛(wèi)康明科技有限公司）；MS105DU型分析天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（ThermoElectrom公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；CHA-S型數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠）；TL-820A型全自動(dòng)切片機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；PNHW型電熱套（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Hei-VAP Value Digital型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph儀器有限公司）；Western電泳儀（美國(guó) Bio-Rad公司）；JS-1070化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）。

2 方法

2.1 提取物制備 川芎醇提物制備：稱取500 g川芎，加入10倍體積的80%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，減壓濃縮至干浸膏，加蒸餾水溶解至所需溶液濃度。

川芎水提物制備：稱取500 g川芎，加入10倍體積水煎煮2次，每次1.5 h，合并2次提取液，減壓濃縮至干浸膏，加蒸餾水溶解至所需溶液濃度。

2.2 分組與給藥 取健康SD大鼠56只，隨機(jī)分成7組，分別為空白組（給予等量蒸餾水）、模型組（給予等量蒸餾水）、陽性對(duì)照藥鹽酸地爾硫卓組（20 mg·kg-1）、川芎醇提物高劑量組（1 200 mg·kg-1）、川芎醇提物低劑量組（600 mg·kg-1）、川芎水提物高劑量組（1 200 mg·kg-1）、川芎水提物低劑量組（600 mg·kg-1）。連續(xù)灌胃給藥14 d。

2.3 ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血模型建立 參照Karthick等[11]的方法，通過前期對(duì)ISO給藥劑量的考察，稍作改動(dòng)建立心肌缺血模型。除空白組外其余各組于第13天、第14天，皮下注射ISO 40 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)注射2 d進(jìn)行模型制備?？瞻捉M注射等體積的生理鹽水，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水和進(jìn)食。在第14天給藥1 h后，隨即用水合氯醛腹腔注射麻醉，將電極分別插入大鼠四肢皮下，監(jiān)測(cè)注射ISO后20 min內(nèi)Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化。判定大鼠陽性心肌缺血標(biāo)準(zhǔn)為（出現(xiàn)以下指征之一者）：①J點(diǎn)偏移大于0.1 mV；②T波高聳，超過同導(dǎo)聯(lián)R波的1/2；③T波高聳伴J點(diǎn)移位[12]。

2.4 心臟指數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，快速摘取心臟，用生理鹽水洗凈，再用濾紙吸干多余水分，稱取心臟質(zhì)量，心臟質(zhì)量除以大鼠體質(zhì)量，計(jì)算各組大鼠心臟指數(shù)。

2.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 測(cè)完心電圖后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清冷凍保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟，分別測(cè)定各組大鼠血清中CK，LDH，AST，SOD，MDA和T-AOC等生化指標(biāo)。

2.6 心肌組織病理學(xué)觀察 取心肌組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE） 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化。

2.7 Western blot 法測(cè)定心肌Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達(dá) 取心臟組織，加入含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液低溫研磨，充分裂解，于4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白變性處理后，取等量總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉。再加入稀釋后的Nrf2，NQO1和HO-1抗體，4 ℃孵育過夜，TBST液洗滌3次，每次10 min。加入相應(yīng)稀釋后的二抗，室溫孵育4 h，TBST液洗膜3次，每次10 min。用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)各組大鼠蛋白表達(dá)情況。endprint

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料用±s表示。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)；然后多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 川芎提取物對(duì)心肌缺血大鼠心臟指數(shù)的影響 與空白組相比，模型組大鼠心臟明顯水腫，心外膜可見部分灰白色區(qū)域，大鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值即心臟指數(shù)明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，鹽酸地爾硫卓組顯著降低心肌缺血大鼠心臟指數(shù)（P<0.01）；川芎醇提物與水提物高、低劑量組均能降低心臟指數(shù)，改善心肌缺血大鼠心肌水腫程度（P<0.05或P<0.01）。與川芎水提物同劑量組相比，川芎醇提物組減輕心肌水腫效果更為顯著（P<0.01），見圖1。

3.2 川芎提取物對(duì)心肌缺血大鼠血清心肌酶的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中CK，LDH和AST含量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，鹽酸地爾硫卓組大鼠血清中CK，LDH和AST含量顯著下降（P<0.01）；川芎醇提物與水提物各劑量組均能減少心肌缺血大鼠血清中CK，LDH和AST的含量（P<0.05或P<0.01），且川芎醇提物組比相同劑量的川芎水提物組效果更為明顯（P<0.05或P<0.01），見表1。

3.3 川芎提取物對(duì)心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激的影響 與空白組相比，心肌缺血模型組大鼠血清中MDA含量明顯升高，SOD與T-AOC活力顯著下降（P<0.01）；與模型組比較，鹽酸地爾硫卓組大鼠血清中MDA含量明顯下降，同時(shí)SOD與T-AOC活力明顯提高（P<0.01）；川芎各給藥組大鼠血清中MDA含量降低，SOD與T-AOC活力也有一定程度的升高（P<0.05或P<0.01），且川芎醇提物組比同劑量的川芎水提物組效果顯著（P<0.05或P<0.01），見表2。

3.4 川芎提取物對(duì)心肌缺血大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響 取染色后的心肌組織切片在光鏡下觀察，見圖2。空白組大鼠心肌纖維排列整齊，組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核形態(tài)正常，間質(zhì)無水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌損傷明顯，心肌纖維排列紊亂，肌束間隔增寬，并出現(xiàn)廣泛性心肌纖維斷裂，空泡樣變性明顯，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；鹽酸地爾硫卓組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，局灶性斷裂，細(xì)胞間隙水腫減輕，間質(zhì)內(nèi)偶見部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。川芎醇提物高劑量組大鼠心肌纖維輕度排列紊亂，肌束間隔略增寬，局部少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。川芎醇提物低劑量組與川芎水提物高劑量組大鼠心肌纖維中度紊亂，輕中度空泡樣變性，肌束間隔中度增寬，輕度水腫，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。川芎水提物低劑量組大鼠心肌纖維局灶性斷裂，空泡樣變性明顯，間質(zhì)有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.5 川芎提取物對(duì)心肌缺血大鼠Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，各給藥組Nrf2，NQO1和HO-1蛋白表達(dá)均增加（P<0.05或P<0.01），其中川芎醇提物組比相同劑量的川芎水提物組增加明顯（P<0.05或P<0.01），見圖3。

4 討論

心肌缺血損傷是多種心血管疾病的始動(dòng)因素和主要病理特征，與臨床上心絞痛、心肌梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、血管痙攣等病癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。心肌缺血損傷發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，現(xiàn)代研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)是其發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。正常生理?xiàng)l件下，心肌組織的氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡 狀態(tài)，ROS生成較少，維持基礎(chǔ)水平；病理狀態(tài)下，心肌缺血的過程中，平衡被打破，ROS大量產(chǎn)生，組織抗氧化能力下降，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的過氧化，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞、蛋白變性、DNA鏈斷裂，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、凋亡或壞死[2]。因此，靶向減少ROS水平的抗氧化干預(yù)措施將有效延緩和預(yù)防心肌缺血損傷。

在本研究中采用皮下注射異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血的病理過程。異丙腎上腺素作為β-受體激動(dòng)劑，能夠通過收縮冠狀動(dòng)脈、增加心肌收縮力、加快心率等環(huán)節(jié)，造成心肌耗氧量增加，心臟負(fù)荷過重，心肌微循環(huán)障礙，冠狀動(dòng)脈痙攣，心肌梗死樣變化等，進(jìn)而誘發(fā)心肌缺血。SOD是機(jī)體清除ROS抗氧化防御系統(tǒng)中重要酶，它可清除超氧陰離子，保護(hù)心肌組織免受自由基損傷，其活性能夠反映機(jī)體的抗氧化儲(chǔ)備功能狀態(tài)[13]。MDA為ROS與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反映的終產(chǎn)物，其含量可以間接反映脂質(zhì)過氧化程度[14]。T-AOC代表機(jī)體抗氧化物的總體水平，可以綜合反映心肌組織的清除ROS的能力。本研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血模型組血清SOD與T-AOC活力顯著下降，MDA含量明顯增加，說明氧化應(yīng)激參與了心肌缺血的病理過程，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[15]。川芎各提取物組均可顯著抑制大鼠血清SOD，T-AOC活性的下降和MDA含量的升高，且川芎醇提物組比水提物組效果顯著，提示川芎各提取物能有效減輕異丙腎上腺素所致心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激損傷，川芎醇提物抗氧化作用強(qiáng)于水提物。

Nrf2通路是近年來發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在氧化應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答中起到樞紐的作用，且在心血管系統(tǒng)中分布廣泛，與改善心肌缺血損傷密切相關(guān)[16]。通常其發(fā)揮抗氧化作用方式有：一方面，氧化應(yīng)激可促進(jìn)Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄，使得Nrf2蛋白合成增加；另一方面，當(dāng)機(jī)體受到親電子物質(zhì)，ROS或者上游信號(hào)通路刺激時(shí)，Nrf2與其伴侶蛋白Keap1 解離，Nrf2被激活，使得由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中的Nrf2增加，繼而與肌腱纖維瘤蛋白以異二聚體形式與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE） 結(jié)合，然后通過上調(diào)下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因NQO1和HO-1等的表達(dá)減輕氧化應(yīng)激損傷[17-18]。本研究顯示異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血氧化損傷過程中，Nrf2，NQO1，HO-1蛋白水平顯著下調(diào)。提示心肌細(xì)胞的抗氧化能力下降，導(dǎo)致自由基代謝失衡，引起心肌損傷。但與模型組相比，川芎各提取物組Nrf2，NQO1，HO-1蛋白水平均有不同程度升高，川芎醇提物比水提物更為明顯，考慮川芎提取物能夠激活Nrf2，促進(jìn) Nrf2 蛋白的合成和核轉(zhuǎn)位，上調(diào)下游NQO1，HO-1 基因表達(dá)及蛋白合成，發(fā)揮抗心肌缺血損傷的作用。endprint

川芎作為臨床常用的活血化瘀藥，現(xiàn)代科學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)川芎及其活性成分可以有效預(yù)防和治療心肌缺血損傷[19-21]。本研究同樣表明，川芎提取物對(duì)大鼠心肌缺血損傷具有一定程度的保護(hù)作用，且川芎醇提物比水提物藥效更為顯著，可以明顯降低心肌指數(shù)，減少心肌酶CK，LDH及AST的泄漏，減輕心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷，同時(shí)提高血清中SOD與T-AOC活力，減少M(fèi)DA含量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)川芎提取物預(yù)處理后，可增加Nrf2表達(dá)，激活下游抗氧化基因NQO1，HO-1的表達(dá)從而減輕心肌缺血氧化應(yīng)激損傷，提示Nrf2信號(hào)通路在川芎提取物對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)中發(fā)揮著重要作用，這為川芎在臨床上的合理應(yīng)用提供了寶貴的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint