外源人參三萜皂苷對(duì)新林土中土壤微生物群落的影響

張愛華+雷鋒杰+傅俊范+周如軍+張連學(xué)

[摘要] 人參皂苷不僅是人參主要的藥用活性物質(zhì)，而且人參皂苷是人參化感作用的主要化感物質(zhì)，其在人參植株生長(zhǎng)及生態(tài)適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。為了研究人參皂苷對(duì)土壤微生物群落的影響，采用外源添加的方式研究人參總皂苷對(duì)新林土中微生物群落動(dòng)態(tài)的影響，分析新林土中微生物群落代謝活性的變化趨勢(shì)，探討人參皂苷對(duì)土壤微生物群落的生態(tài)學(xué)效應(yīng)。與對(duì)照相比，加入人參總皂苷10 d和40 d后新林土中土壤微生物群落的代謝活性均顯著高于對(duì)照組，處理10 d后土壤微生物群落多樣性指數(shù)除了均勻度指數(shù)（E）外，其他多樣性指數(shù)隨皂苷濃度升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其中，低濃度處理碳源利用豐富度指數(shù)（S）與對(duì)照相比差異顯著。后期除了均勻度指數(shù)（E）外，其他多樣性指數(shù)高于對(duì)照。人參總皂苷可改變新林土中土壤微生物群落的組成和代謝活性，人參皂苷在土壤中的積累可以改變土壤微生態(tài)環(huán)境從而影響人參生長(zhǎng)。

[關(guān)鍵詞] 人參皂苷； 土壤微生物群落； Biolog法

[Abstract] Ginsenosides are the main active ingredient and allelochemicals of Panax ginseng， and they play an important role in ginseng growth and in ecological adaptation. To study the influence of ginsenosides on soil microbial communities， the method of given exogenous total ginsenosides of different concentrations were used to study the influence of ginsenosides on new forest soil microbial community， evaluate the change of metabolic activity of microbial community and investigate the ecological effect of ginsenosides on soil microbial community. Results showed that， exogenous total ginsenosides promoted metabolic activity of microbial community in new forest soil at different concentrations compared with the control after 10 d and 40 d treatment. After 10 d，except for the Evenness index， all of the other indices indicated that the functional diversity of the soil microbial community in the new forest firstly increased then decreased with increase of the total ginsenosides concentration. The Substrate richness for 0.01 g·L-1 soil treatment was significantly different from that of the control. After 20 d， 30 d and 40 d， except for the Evenness index， all of the other indices indicated that the functional diversity of the soil microbial community in the new forest increased with total ginsenosides. These results suggested that ginsenosids can change soil microbial community and microbial metabolic activity， which alter soil microbial ecology and accordingly affect the growth of ginseng with accumulation of ginsenosides in the soil.

[Key words] ginsenoside； soil microbial community； Biolog method

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其在物質(zhì)與能量循環(huán)、土壤結(jié)構(gòu)及土壤微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用。人參是多年生宿根植物，對(duì)生境要求極其苛刻，野生人參多生長(zhǎng)在海拔400～1 000 m的崗地或各種類型的山地半山坡上，土壤為微酸性（pH 5.5～6.5）的棕色森林土或山地灰化棕色森林土，坡度為5～44°的針闊葉混交林或雜木林下[1]。張夢(mèng)昌等[2]發(fā)現(xiàn)老參地土壤微生物的生物量顯著下降，生理類群發(fā)生明顯改變；在人參根表面微生物種群中，真菌比例較根際有所增加，放線菌幾乎為零。李勇等[3]報(bào)道隨人參生長(zhǎng)年限的增加，人參根區(qū)土壤中真菌數(shù)量逐年升高，其中以鐮刀菌的增長(zhǎng)最為顯著，木霉菌含量反而明顯降低；細(xì)菌和放線菌數(shù)量逐年降低，且細(xì)菌數(shù)量的變化較放線菌更為顯著。研究表明，老參地土壤微生物群落的變化致使土壤微生物中有益菌對(duì)人參根腐病菌的拮抗作用降低，導(dǎo)致人參根部病害加重[4-5]。

人參、西洋參根系與根際土壤微生物的相互影響作用已經(jīng)得到了廣泛關(guān)注，人參皂苷作為人參、西洋參根系分泌物中主要的化感物質(zhì)，其對(duì)土壤微生物的作用不容忽視[6-8]，但未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，為了進(jìn)一步探討人參皂苷對(duì)土壤微生物群落的影響作用，采用外源添加的方式研究人參總皂苷對(duì)新林土中微生物群落動(dòng)態(tài)分布及影響。旨在通過(guò)觀察新林土中的微生物群落的代謝活性的變化趨勢(shì)，分析人參皂苷對(duì)土壤微生物種群的生態(tài)學(xué)效應(yīng)，從而探究人參、西洋參合成、分泌人參皂苷在調(diào)節(jié)根際土壤微生態(tài)方面的作用和地位。endprint

1 材料

試驗(yàn)用人參總皂苷（純度99%以上）由吉林省人參工程技術(shù)研究中心提供；新林土采自吉林省臨江市大栗子鎮(zhèn)望江村周邊山上的闊葉林中（地理位置坐標(biāo)，N126.861 902，E41.765 97），林區(qū)主要樹種有蒙古櫟、核桃楸、黃柏、紫椴、槭樹等；主要草本植物有茜草、艾蒿、月見草、尾葉香茶菜等。采用五點(diǎn)取樣法采集0～20 cm深的土壤。

2 方法

2.1 人參總皂苷溶液的配制

參考文獻(xiàn)及前期實(shí)驗(yàn)確定人參皂苷濃度設(shè)計(jì)[8-9]，精確稱量人參總皂苷0.1 g，用蒸餾水溶解后定容至100 mL，即得到質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1的人參總皂苷溶液，依次稀釋可得到質(zhì)量濃度為0.1，0.01 g·L-1的人參總皂苷溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 土壤微生物的培養(yǎng)

將采集的新林土過(guò)40目篩，去除石塊和枯枝落葉等植物殘?bào)w后，分裝到玻璃培養(yǎng)皿中（Φ=15 cm），每個(gè)平皿裝255 g（土壤含水量為21.5%，相當(dāng)于200 g烘干土重）。然后向每個(gè)培養(yǎng)皿的新林土中加入50 mL不同質(zhì)量濃度（1.0，0.1，0.01 g·L-1）的人參總皂苷溶液（使每100 g土中含有的人參皂苷量分別達(dá)到25，2.5，0.25 mg），用玻璃棒攪拌均勻后，加蓋置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在26 ℃條件下黑暗培養(yǎng)40 d。采用五點(diǎn)取樣法每10 d取1次土樣，每次取樣15.0 g，將土樣裝入滅菌的塑封袋內(nèi)，放于4 ℃的冰箱內(nèi)保存，備用。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。以蒸餾水處理為對(duì)照。

2.3 Biolog-ECO法測(cè)定土壤微生物群落的功能多樣性

具體步驟：①?gòu)乃芊獯袦?zhǔn)確稱取7.35 g（相當(dāng)于5.0 g干土，含水量31.97%）土放入盛有45 mL無(wú)菌水的三角瓶（150 mL）中接種，用渦旋振蕩機(jī)振蕩3 min，將土樣充分打散；②振蕩后立即吸取10 mL污泥到50 mL離心管中，在1萬(wàn)r·min-1下離心20 min，棄去上清液，再加入10 mL已滅菌的生理鹽水 （0.85%NaCl）；在振蕩機(jī)上振動(dòng)3 min，使之混勻；③然后，再于1萬(wàn)r·min-1下離心20 min，洗去其中的碳源；棄去上清液，加10 mL生理鹽水，于振蕩機(jī)上振動(dòng)3 min，使之混勻，并在2 000 r·min-1條件下離心1 min。④用移液器吸取1 mL上清液加入裝有9 mL已滅菌生理鹽水的試管中，并使其A590維持在（0.13±0.02）；⑤將加入菌懸液的試管在渦旋振蕩機(jī)上振蕩30 s，使之混勻。

用移液器將上述菌懸液加入Biolog-ECO微平板中，每孔150 μL，對(duì)照孔加無(wú)菌生理鹽水；然后在溫度為25 ℃，濕度為40%的條件下黑暗培養(yǎng)，每隔24 h用MicroStationTM-2讀取數(shù)據(jù)，連續(xù)測(cè)定7 d。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析[10-11]

采用Excel （2007版）軟件計(jì)算AWCD值，選取72 h的平均顏色變化率AWCD計(jì)算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)，單因素方差分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。

3 結(jié)果分析

3.1 人參總皂苷對(duì)新林土中土壤微生物群落代謝活性的影響

ECO平板微孔內(nèi)的平均顏色變化率（AWCD）反映了土壤微生物的代謝活性，是土壤微生物群落代謝活性的重要指標(biāo)[12]。在平板培養(yǎng)期間，使用MicroStationTM-2每24 h測(cè)定1次AWCD，得到AWCD隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化圖（圖1）。

以上結(jié)果表明，新林土中在加入人參總皂苷以后，微生物群落的代謝活性發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明人參總皂苷改變了微生物群落的代謝活性，并且對(duì)土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生了一定影響。在加入人參總皂苷第10天，新林土中土壤微生物群落的代謝活性顯著增強(qiáng)，說(shuō)明人參皂苷在處理的前期可以促進(jìn)土壤微生物群落的生長(zhǎng)，并且中質(zhì)量濃度0.1 g·L-1處理的促進(jìn)效果最為顯著。在加入人參總皂苷第20天后，新林土中土壤微生物群落的代謝活性再次發(fā)生改變，中濃度的人參總皂苷對(duì)微生物代謝的促進(jìn)作用相對(duì)減弱，而高濃度和低濃度處理中土壤微生物的代謝活性明顯受到抑制。人參總皂苷加入到新林土中第30天以后，其對(duì)土壤微生物群落代謝活性的影響與對(duì)照相比，并無(wú)顯著差異。但是，新林土中在加入人參總皂苷第40天后，不同處理的土壤微生物群落的代謝活性產(chǎn)生了新的變化，低濃度處理組中的土壤微生物代謝活性最強(qiáng)，且明顯高于中、高濃度處理過(guò)的土壤。由此可見，采用不同濃度的人參皂苷處理新林土和土壤培養(yǎng)時(shí)間均與土壤微生物群落代謝活性有直接關(guān)系。

3.2 人參總皂苷對(duì)新林土中土壤微生物群落多樣性指數(shù)的影響

3.2.1 處理第10天土壤微生物群落多樣性的變化 在加入人參總皂苷10 d以后，中濃度（0.1 g·L-1）處理的新林土中土壤微生物群落碳源利用豐富度指數(shù)、物種豐富度指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均高于對(duì)照和高濃度（1.0 g·L-1）、低濃度（0.01 g·L-1）處理，但均勻度指數(shù)最低，說(shuō)明土壤微生物群落中的某些類群得到人參皂苷的刺激，迅速增殖，代謝旺盛，成為群落內(nèi)的優(yōu)勢(shì)種群；低濃度（0.01 g·L-1）處理的均勻度指數(shù)最高，說(shuō)明群落的組成變化較小，各種群對(duì)人參皂苷的反應(yīng)不敏感；而高濃度（1.0 g·L-1）處理組各種指數(shù)均與低濃度處理組的差異均不顯著（表1）。

3.2.2 處理第20天土壤微生物群落多樣性的變化 在加入人參總皂苷20 d以后，對(duì)照組新林土中土壤微生物群落碳源利用豐富度指數(shù)、物種豐富度指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均高于不同濃度的總皂苷處理組，但均勻度指數(shù)最低，與第10天相比，碳源利用豐富度指數(shù)顯著增加，代謝變得旺盛；低濃度（0.01 g·L-1）處理的均勻度指數(shù)仍然最高，碳源利用豐富度最小，推測(cè)可能是某些微生物種群受到人參皂苷的抑制，代謝活性較低的緣故，但物種豐富度僅低于對(duì) 照組，說(shuō)明保留了相對(duì)較多的微生物種群；而高濃度（1.0 g·L-1）處理的碳源利用豐富度指數(shù)高于中濃度（0.1 g·L-1）處理，但物種豐富度和均勻度均低于中濃度處理，可能是高濃度的人參皂苷對(duì)某些微生物種群產(chǎn)生的抑制作用更強(qiáng)的緣故（表2）。endprint

3.2.3 處理第30天土壤微生物群落多樣性的變化 加入人參總皂苷30 d以后，中濃度（0.1 g·L-1）處理的土壤微生物群落碳源利用豐富度指數(shù)、物種豐富度指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均高于其他處理，同時(shí)均勻度指數(shù)也高于高濃度（1.0 g·L-1）和低濃度（0.01 g·L-1）處理的土壤，可能此濃度的人參總皂苷對(duì)土壤微生物群落的抑制作用最弱，微生物種群比高濃度處理的微生物種群更豐富，而促進(jìn)作用又較低濃度處理更強(qiáng)的緣故；對(duì)照組處理的均勻度指數(shù)最高，說(shuō)明群落的組成變化較小，各種群落分布比較均勻；而高濃度（1.0 g·L-1）處理組均勻度指數(shù)最低，說(shuō)明某些種群受到顯著的抑制（表3）。

3.2.4 處理第40天土壤微生物群落多樣性的變化 在40 d時(shí)，人參總皂苷低濃度（0.01 g·L-1）處理的新林土中土壤微生物群落碳源利用豐富度指數(shù)、物種豐富度指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均高于其他處理，說(shuō)明此濃度處理的土壤微生物群落種群最為豐富，并且其代謝較對(duì)照組有顯著的促進(jìn)作用，但某些類群開始大量繁殖，占據(jù)了較多的生境，造成均勻度下降；此時(shí)高濃度（1.0 g·L-1）處理中人參皂苷的抑制作用開始減弱，物種豐富度增加，相應(yīng)的受到促進(jìn)的某些微生物種群降低了群落的均勻度；而中濃度（0.1 g·L-1）處理在40 d時(shí)對(duì)微生物的促進(jìn)和抑制作用逐漸達(dá)到平衡，與對(duì)照相比總體表現(xiàn)出促進(jìn)作用（表4）。

4 結(jié)果與討論

人參皂苷作為人參的主要次生代謝產(chǎn)物，承擔(dān)著重要的生態(tài)學(xué)作用，在人參與環(huán)境的相互作用中 扮演著重要角色[13]。

人參皂苷在一至四年生參根中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到3%～8%，主要分布于參根最外層的周皮中，這些化合物可以通過(guò)根系分泌以及須根的季節(jié)性脫落進(jìn)入土壤；生長(zhǎng)旺盛的根系或新根分泌能力較強(qiáng)。另外，在人參收獲后大量參根殘留于田間，也可釋放人參皂苷至土壤中，因此，人參皂苷也被認(rèn)為是人參中主要的化感物質(zhì)，參地土壤中的人參皂苷可能會(huì)由于人參生理代謝而維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的濃度。楊靖春報(bào)道，新林土栽參組為0.280 mg·g-1土，老參地連栽參為0.24 mg·g-1土，老參地輪作組為0.108 mg·g-1土[9]。Nicol[6]測(cè)得西洋參根際土壤中人參總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200～980 mg·kg-1。在人參皂苷濃度設(shè)計(jì)中參考了前人的研究結(jié)果。加拿大學(xué)者Bernards對(duì)西洋參進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其根系分泌物中含有的人參皂苷成分對(duì)土傳病原菌——Phytophthora cactorum疫病菌和Pythium irregulare畸雌腐霉菌的生長(zhǎng)有顯著地促進(jìn)作用；而相同條件下，對(duì)Trichoderma hamatum鉤狀木霉的生長(zhǎng)則表現(xiàn)出輕微的抑制作用[6]。這表明，人參、西洋參產(chǎn)生的人參皂苷可對(duì)病原微生物的生長(zhǎng)繁殖及根際微生物群落的動(dòng)態(tài)變化產(chǎn)生顯著地影響。

Biolog方法已越來(lái)越多的應(yīng)用于土壤生態(tài)學(xué)的研究中。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的AWCD曲線的總體趨勢(shì)符合微生物生長(zhǎng)的“J”型曲線，反映了土壤微生物在平板上的代謝活性變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，土壤微生物群落的代謝活性隨時(shí)間的變化而略有差異，但在加入不同濃度的人參總皂苷以后，其代謝活性在時(shí)間上的變化十分顯著；在實(shí)驗(yàn)初期，新林土中土壤微生物群落的代謝活性明顯升高，說(shuō)明人參總皂苷對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，且中濃度（0.1 g·L-1）的促進(jìn)作用最為顯著；而隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，某些具有抑制作用的人參皂苷開始發(fā)揮作用，某些類群的生長(zhǎng)受到抑制，土壤微生物代謝活性降低；但在處理40 d時(shí)，某些受到促進(jìn)的土壤微生物類群又開始占據(jù)生境，成為優(yōu)勢(shì)種群，代謝活性又開始增強(qiáng)，高濃度處理尤為明顯。

實(shí)驗(yàn)中AWCD和土壤微生物群落多樣性指數(shù)的波動(dòng)性變化可能與加入到新林土中的人參總皂苷被代謝掉有關(guān)，人參皂苷在土壤中的含量隨著時(shí)間的增加而逐漸減少，因此對(duì)土壤微生物群落的定向選擇壓力也逐漸降低，從而呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢?0 d）所表現(xiàn)出的結(jié)果。這與人參實(shí)際生長(zhǎng)情況不同。在栽培過(guò)程中，人參根系持續(xù)向環(huán)境中分泌人參皂苷，根際土中人參皂苷的含量是逐漸升高的，因此，其對(duì)土壤微生物群落的定向選擇作用是持續(xù)增強(qiáng)的，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的單一化趨勢(shì)更為明顯。

人參總皂苷對(duì)土壤微生物群落的功能多樣性具有顯著的影響。在實(shí)驗(yàn)初期，群落的物種豐富度增加，均勻度較好，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，土壤微生物群落的功能多樣性發(fā)生顯著變化，物種豐富度先降低，在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢?0 d）又開始升高，均勻度指數(shù)則一直降低。這說(shuō)明人參總皂苷改變了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成，致使某些微生物類群大量增殖，成為土壤生境中的優(yōu)勢(shì)種，但同時(shí)群落的代謝類型趨于單一。這與前人的報(bào)道相符。人參根系分泌物對(duì)土壤微生物的定向選擇壓力可能是造成土壤微生物種群遺傳多樣性變化的主要原因，人參、西洋參根際土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)的變化是導(dǎo)致其生態(tài)功能紊亂進(jìn)而產(chǎn)生連作障礙的關(guān)鍵因素[14]。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint