不同適應(yīng)溫度對鎘暴露中大型溞生理和亞細(xì)胞水平的作用

李爽,盛連喜,姜海波

1. 北華大學(xué)林學(xué)院環(huán)境科學(xué)系, 吉林 132013 2. 東北師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)系, 長春 130024

污染物的毒理學(xué)實驗一般在20 ℃或者在測試生物的最適飼養(yǎng)溫度下進(jìn)行。但溫度是非常重要的生態(tài)因子，溫度的改變會影響水生生物的代謝、移動、覓食活動從而影響其吸收、清除和解毒速率[1-3]。溫度變化誘導(dǎo)的保護(hù)蛋白也會改變生物對化合物的敏感性[4]。在溫度耐受限附近，溫度本身也會變成環(huán)境壓力并且擴(kuò)大污染物對生物的副作用[5-6]。有研究顯示[7]：實驗溫度和適應(yīng)溫度的不同可能導(dǎo)致污染物的毒性作用被低估。

鎘是一種劇毒金屬，由冶煉等過程釋放到環(huán)境中，具有高毒性、難降解、易殘留等特點[8]。鎘能引起DNA損傷和氧化應(yīng)激，損害繁殖，干擾生物體內(nèi)的電子平衡[9]。不同適應(yīng)溫度對鎘生物效應(yīng)的影響未見報道。大型溞(Daphniamagna)是一種重要的水生生物，是水生食物鏈中重要的一環(huán)。本研究中，大型溞在20 ℃(一般毒性試驗中使用的標(biāo)準(zhǔn)溫度)、24 ℃和28 ℃下適應(yīng)三代后暴露于0、20和40 μg·L-1的鎘溶液中6 h，測定其子代48 h急性毒性、21 d存活率、21 d累積繁殖數(shù)(21-d CR)、第一次生育時間(TFB)、能量儲存和電子轉(zhuǎn)移活性(ETS)、熱應(yīng)激蛋白hsp70和金屬硫蛋白(MT)的變化。我們期望通過以上指標(biāo)的調(diào)查增加對溫度在污染物暴露中作用的理解，為生態(tài)毒理學(xué)評價提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 適應(yīng)條件

本研究中使用的大型溞來自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，已經(jīng)在本實驗室培養(yǎng)10年以上。大型溞培養(yǎng)在不含EDTA的M7介質(zhì)中，光照比16 h:8 h，溫度20 ℃[10]。把馴養(yǎng)3 d的大型溞隨機(jī)分成3組，其中2組使用魚缸加熱器(HCH-50W, 創(chuàng)星，中山)將水溫以1 ℃·d-1的速度加熱到24 ℃和28 ℃，另一組繼續(xù)在20 ℃下培養(yǎng)。3組的后代分別再各自溫度下適應(yīng)3代，第4代用于鎘暴露。一周更新培養(yǎng)介質(zhì)2次，同時丟棄新生個體。大型溞每天3次喂以懸浮綠藻(羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata))，喂食率大約2×105cells·(mL·d)-1。藻按照ISO 8692指導(dǎo)培養(yǎng)[11]。

1.2 實驗程序

試驗使用氯化鎘(分析純, 德國默克)進(jìn)行，0.2%的硝酸酸化。對照也同樣進(jìn)行酸化。配制1 g·L-1鎘儲備液。測試液中的鎘濃度使用火焰原子吸收光譜(M1100, 美國,鉑金埃爾默)進(jìn)行分析，1 g·L-1鎘標(biāo)準(zhǔn)液(德國默克)。實驗稀釋水為不含EDTA的M7介質(zhì)。測量濃度和名義濃度的偏差不大于10%。對照和暴露后所有水中的未檢出鎘。

適應(yīng)三代后的鎘急性毒性實驗根據(jù)OECD 202標(biāo)準(zhǔn)[12]大型溞急性毒性試驗進(jìn)行，暴露溫度為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的20℃。

鎘暴露實驗使用經(jīng)實驗室馴養(yǎng)3 d的大型溞進(jìn)行。暴露時間為6 h，鎘濃度分別為0(對照組)，20和40 μg·L-1。暴露后生物轉(zhuǎn)移到對照水體中，分成2部分：(1)根據(jù)OECD大型溞繁殖實驗，生物一直培養(yǎng)21 d，記錄大型溞21 d的存活率、第一次繁殖時間(TFB)和繁殖數(shù)(幼體數(shù)，21-d CR)；(2)暴露3 d后收集大型溞，在-80 ℃的液氮下冷凍直至測量(能量儲存，電子轉(zhuǎn)移活性(ETS)，hsp70和MT)。

采用蒽酮比色法測定糖含量、采用索氏抽提法測定脂肪含量、采用考馬斯亮蘭染色法測定蛋白質(zhì)含量，三者的總和為大型溞的能量儲存；采用氯化碘硝基四氮唑 (INT) 分光光度法測定電子轉(zhuǎn)移活性(ETS)[13]；采用SDS-PAGE電泳凝膠法[14-15]測定hsp70的變化；采用銀飽和法測定MT的變化[16]。

1.3 統(tǒng)計分析

48 h-EC50s及95%的置信區(qū)間使用Origin軟件計算(8.0 SR4, OriginLab Corporation, USA)；采用Shapiro-WilkW檢驗法進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗；使用Friedmann ANOVA進(jìn)行各個處理之間的差異分析；滿足正態(tài)分布和同質(zhì)性假設(shè)的48 h-EC50s值進(jìn)行單因素方差分析(Dunnett 檢驗)；能力儲存、電子轉(zhuǎn)移活性(ETS)、hsp70、MT值用非參數(shù)的Wilcoxon秩檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 急性毒性

急性毒性試驗結(jié)果如圖1(A)。大型溞的平均急性鎘耐性隨著適應(yīng)溫度的升高而降低。48 h-EC50從20 ℃的(40.2±9.9) μg·L-1降低到24 ℃的(15.6±2.7) μg·L-1和28 ℃的(10.7±1.9) μg·L-1，不同適應(yīng)溫度下差異顯著。

2.2 21 d存活和繁殖

圖1(B)為鎘暴露后大型溞的21 d存活率，對照組升高的適應(yīng)溫度并不影響大型溞的存活。20 μg·L-1鎘暴露下，28 ℃的適應(yīng)溫度會導(dǎo)致存活率一個明顯的、大約23%的降低。40 μg·L-1鎘暴露下，24 ℃和28 ℃的適應(yīng)溫度都會導(dǎo)致存活率的明顯變化，分別降低18%和87%左右。單一的溫度適應(yīng)和鎘暴露并不影響大型溞的存活率，但雙因素方差分析顯示了一個明顯的溫度×鎘的相互作用(表2)。

圖1 (A)不同適應(yīng)溫度下大型溞的48 h-EC50及其標(biāo)準(zhǔn)偏差；(B)第4代大型溞在鎘暴露之后的21 d存活率注：差異性分析中第一個字母代表不同適應(yīng)溫度下的差異，第二個字母代表不同鎘濃度下的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 1 (A) 48 h EC50 values with standard deviation (error bars) for three generations of Daphnia magna which have acclimated to different temperature; (B) 21-days survival with standard deviation (error bars) of fourth generation of D. magna after different Cd exposure Note: The first letter represents the difference between different temperatures under the same concentrations and the second represents the difference between different concentrations under the same temperature. Different letters indicate significant differences at P<0.05.

表1為存活溞的第一次生產(chǎn)時間(TFB)和21-d累積繁殖數(shù)(21-d CR)?？傮w上，20 ℃和24 ℃的適應(yīng)溫度下鎘暴露并不影響大型溞的TFB和21-d CR，只有24 ℃時20 μg·L-1的鎘暴露增加了TFB、24 ℃時40 μg·L-1的鎘暴露降低了21-d CR。在28 ℃，鎘暴露明顯降低21-d CR且40 μg·L-1的暴露也明顯增加了TFB。

2.3 能量儲存和電子轉(zhuǎn)移(ETS)系統(tǒng)活性

圖2(A)為大型溞總能量儲存(總的蛋白、糖和脂肪)的變化。能量儲存隨溫度的升高而降低，24 ℃時分別降低了46%、48%和80%。28 ℃時分別降低了62%、60%和91%。而在同一溫度下，只有鎘濃度達(dá)到40 μg·L-1時，對大型溞的能量儲存有明顯影響。雙因素方差分析顯示溫度、鎘以及溫度×鎘都對能量儲存具有明顯影響。

圖2 不同鎘暴露濃度和不同適應(yīng)溫度下大型溞的能量儲存(A)和電子轉(zhuǎn)移活性(ETS)(B)注：差異性分析中第一個字母代表不同適應(yīng)溫度下的差異，第二個字母代表不同鎘濃度下的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 2 (A) Energy reserves with standard deviation (error bars) and (B) Energy transport system (ETS) activity (oxygen consumption) of Daphnia magna after different Cd exposure and acclimated temperaturesNote: The first letter represents the difference between different temperatures under the same concentration and the second represents the difference between different concentrations under the same temperature. Different letters indicate significant differences at P<0.05.

表1 不同鎘暴露濃度和適應(yīng)溫度下的第一次生育時間(TFB)和21 d累積生殖量(21-d CR)Table 1 Time to first brood (TFB)±SD and 21-d cumulative reproduction (21-d CR) ±SD under different Cd concentrations and temperatures

注：第一個字母代表不同適應(yīng)溫度下的差異，第二個字母代表不同鎘濃度下的差異。不同的字母代表P<0.05。

Note： The first letter represents the difference between different temperatures under the same concentration and the second represents the difference between different concentrations under the same temperature. Different letters indicate significant differences atP<0.05.

圖2(B)為大型溞電子轉(zhuǎn)移活性(ETS)的變化。任何適應(yīng)溫度和鎘濃度下，ETS之間并無顯著差異。雙因素分析也并未顯示任何明顯的作用。

2.4 熱應(yīng)激蛋白hsp70

圖3為不同適應(yīng)溫度和鎘濃度下hsp70的變化。對照組只有適應(yīng)溫度為28 ℃時hsp70明顯增加。20 μg·L-1鎘暴露下，溫度從20 ℃升高到24 ℃時hsp70明顯上升，24 ℃和28 ℃之間沒有變化。40 μg·L-1鎘暴露下，當(dāng)溫度從20 ℃升高到24 ℃時hsp70明顯上升，而28 ℃時的hsp70明顯低于24 ℃時。同時，在20 ℃，40 μg·L-1的暴露能明顯增加hsp70的水平但20 μg·L-1的暴露下hsp70沒有明顯變化。在24 ℃，鎘濃度從0到 20 μg·L-1hsp70的水平隨著鎘濃度的增加而增加，從20 μg·L-1到 40 μg·L-1hsp70的水平隨著鎘濃度的增加而降低。在28 ℃，hsp70的水平隨著鎘濃度的增加而降低。雙因素方差顯示溫度、鎘以及溫度×鎘都對hsp70有明顯作用。

圖3 不同鎘濃度和適應(yīng)溫度下大型溞的hsp70水平注：差異性分析中第一個字母代表不同適應(yīng)溫度下的差異，第二個字母代表不同鎘濃度下的差異。不同的字母代表P<0.05。Fig. 3 Hsp70 levels with standard deviation (error bars) of Daphnia magna after different Cd exposure and acclimated temperaturesNote: The first letter represents the difference between different temperatures under the same concentration and the second represents the difference between different concentrations under the same temperature. Different letters indicate significant differences at P<0.05.

2.5 金屬硫蛋白MT

表2 溫度、鎘及其相互作用對大型溞不同實驗終點影響的雙因素方差分析結(jié)果Table 2 Results for two-way ANOVA for effects of temperature (T), cadmium (Cd) and their interactions on the different endpoints measured in Daphnia magna

注：a數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換。

Note：aData were rank transformed prior to analysis.

圖4為溫度適應(yīng)和鎘暴露對大型溞MT水平的影響。對照組只有適應(yīng)溫度達(dá)到28 ℃才能引起MT水平的變化。而20和40 μg·L-1鎘暴露下，MT水平明顯隨著適應(yīng)溫度的增高而增高。同一溫度下，MT的水平隨著鎘濃度的增加而增加。雙因素方差顯示了單獨鎘和溫度×鎘的相互作用。

3 討論(Discussion)

溫度是生物毒性暴露結(jié)果的重要影響因素，能引起水生變溫生物對金屬暴露的敏化[6-7]。溫度影響大型溞鎘耐性的形成[17]，溫度較高時(從10 ℃到35 ℃)鎘對大型溞的急性毒性更強(qiáng)[4]。這與本研究中48 h-EC50值的變化相一致，這可能是由于溫度較高時生物的代謝增強(qiáng)，促進(jìn)了生物對鎘的吸收。

Work和Gophen (1999)[18]報道溫度影響翼弧溞(Daphnia.lumholtzi)的存活，使其生命周期從20 d(15 ℃)降低為17 d (29 ℃)。但本研究中，對照組大型溞在24 ℃和28 ℃下的存活幾乎不受影響。然而，鎘暴露下溫度明顯降低大型溞的21-d CR(除了24 ℃時20 μg·L-1的鎘暴露)并且這一作用似乎隨著鎘濃度的增加而增加(在28 ℃時，40 μg·L-1的鎘暴露下的存活只有13%)。

能量代謝是維持壓力適應(yīng)和耐性的關(guān)鍵。在變溫生物中，溫度決定生理生化反應(yīng)的速率，升高的溫度導(dǎo)致基礎(chǔ)代謝需要的能量增加。金屬暴露也會導(dǎo)致細(xì)胞為了修復(fù)和解毒而需要進(jìn)行更多的代謝。溫度和有重金屬作用下生物的代謝需求增強(qiáng)，能量儲存降低[19-20]。這與本研究的結(jié)果一致，溫度和鎘暴露都降低大型溞的能量儲存。然而，溫度在鎘對大型溞能量儲存影響中的作用并不確定。20 μg·L-1鎘溶液暴露下，生物的能量儲存并不低于對照組，只有鎘濃度達(dá)到40 μg·L-1時才能觀察到鎘對大型溞能量儲存的影響。

能量儲存的降低意味著由于溫度升高和鎘暴露而增加的能量需求超過了能量供給。但降低的能量儲存并不一定意味著能量供給的降低。生物能通過攝入更多的食物[21]，上調(diào)消化酶，調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能(呼吸和循環(huán))和細(xì)胞代謝機(jī)制，如，線粒體功能來應(yīng)對變化[7]。本研究中，不同的溫度和不同濃度的鎘暴露之間代表細(xì)胞氧消耗和最大代謝活性的ETS活性并沒有顯著差異，ETS活性不受溫度、鎘暴露以及它們的聯(lián)合作用的影響。這一結(jié)果和Muyssen等[22]的研究相似，與Cherkasov等[23]和Lannig等[24]的結(jié)果不同。在前者的研究中，ETS活性不受溫度和鎘的影響，在后面的2個研究中，升高的溫度和鎘會增加生物的氧需求、降低血氧濃度，從而降低ETS活性。這一差異可能是由于溞體內(nèi)的有效呼吸速率并不僅僅與ETS活性相關(guān)[25]。供氧、心率和其他與呼吸有關(guān)的生理過程也可能發(fā)生改變[20]。

為了應(yīng)對較低的能量儲存，生物會降低生育投入以限制能量損失。而本研究中，雖然對照組24 ℃和28 ℃生物的能量儲存降低，但21-d CR并沒有降低。相似的生育數(shù)量并不一定意味著投入給后代的能量相同，生物可能生育更小的后代，這種轉(zhuǎn)換關(guān)系在溫度影響下溞的后代中普遍存在[26]。相比于20 ℃的鎘暴露，28 ℃下大型溞的21-d CR明顯下降。這一結(jié)果與Heugens等[27]的研究不同，他們認(rèn)為溫度并不增強(qiáng)鎘對大型溞繁殖量的副作用，但該研究也報道了升高溫度能強(qiáng)化鎘對種群增長率的副作用[27]。本研究中，由于21-d CR較低，種群增長率會隨之降低。

hsp70能保護(hù)生物免受外界壓力(包括熱壓力和有毒重金屬)的損傷，同時作為分子伴侶，參與蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞周期調(diào)控等重要的生命活動[15, 28-29]。本研究中，hsp70在溫度(28 ℃)升高時顯著上調(diào)，這與已有的對水生生物的研究相似[30-31]。較低的適應(yīng)溫度(24 ℃)并沒有誘導(dǎo)hsp70，也許是因為水生生物hsp70的誘導(dǎo)溫度一般在其適應(yīng)溫度的7～12 ℃以上[32-35]。

經(jīng)過6 h鎘暴露，大型溞hsp70的最高水平出現(xiàn)在中間溫度(24 ℃)，而在最高溫度(28 ℃)時下降，這也許是由于hsp70的合成機(jī)制受到損傷[36]。雖然對照組大型溞hsp70的水平隨著溫度的升高而升高，但鎘暴露大型溞hsp70在高溫時的降低仍舊來自于鎘暴露和溫度的聯(lián)合作用，因為在我們以前的研究中，只有鎘濃度達(dá)到80 μg·L-1以上時，大型溞hsp70的表達(dá)才會受到抑制，而本研究中的鎘濃度只有20 μg·L-1[29]。目前這種損傷的機(jī)制還不清楚。一個可能的解釋是鎘暴露損傷了細(xì)胞的生物合成能力，如轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[37-39]。另一個可能的解釋是溫度和鎘暴露的聯(lián)合壓力導(dǎo)致線粒體功能受損、生物缺乏能量，生物合成hsp70或者h(yuǎn)sp70發(fā)揮功能所需的ATP不足[40]。

金屬硫蛋白(MT)的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)必需和非必需金屬(包括鎘)的水平，幫助生物進(jìn)行金屬解毒[41-42]。對照組升高的溫度(28 ℃)也能引起MT的上調(diào)。這在對其他水生生物溫度作用的研究中也有出現(xiàn)[43-44]。本研究中MT水平在鎘暴露后增加，鎘暴露和溫度的聯(lián)合作用則誘導(dǎo)了更高的MT表達(dá)。眾所周知，鎘通過激活金屬轉(zhuǎn)錄因子MTF-而誘導(dǎo)MT[45-46]，而熱誘導(dǎo)MT的上調(diào)以及結(jié)合作用的機(jī)制并不清楚。有研究者認(rèn)為，和哺乳動物中的反應(yīng)一樣，熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄子(HSF)可能直接誘導(dǎo)MT啟動子[47-48]，或者熱誘導(dǎo)氧化應(yīng)激間接激活MT啟動子中的抗氧化反應(yīng)元件[49-50]。無論溫度以及它與鎘暴露的聯(lián)合作用誘導(dǎo)MT的機(jī)制如何，MT似乎并不應(yīng)該作為金屬暴露的特殊生物標(biāo)志物。

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