DEHP對小鼠精原細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)水平的影響

董瑞娜，劉殊，張敏，戴紅, *，徐肖倩, #

1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特 010110 2. 同煤集團(tuán)職業(yè)病防治院，大同 037003 3. 包頭醫(yī)學(xué)院，包頭 014040

現(xiàn)今，塑料制品已廣泛深入人類生產(chǎn)和生活。為使其滿足人們不同需求，塑料生產(chǎn)過程中使用和消耗了大量的增塑劑，據(jù)報道估計，增塑劑年均全球總產(chǎn)量580萬t，其中75%為鄰苯二甲酸酯(phthalatic-acid esters, PAE)類化合物[1]。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di (2-ethylhexyl)phthalate, DEHP)是PAE的重要組成之一，因它含有與聚合物相容的極性部分和能夠破壞聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)聚合物鏈之間極性相互作用的非極性部分且不與PVC形成共價鍵，所以，其很容易釋放到環(huán)境中，并通過直接接觸和使用進(jìn)入人體，或通過其他PAEs產(chǎn)品以及一般環(huán)境間接暴露[2]。

近年來，大量研究證實DEHP對嚙齒類動物具有生殖和睪丸毒性及抗雄激素效應(yīng)。根據(jù)暴露劑量及作用對象年齡的不同，均表現(xiàn)出不同程度的組織及細(xì)胞損傷，即出現(xiàn)睪丸、附睪萎縮，精細(xì)管畸形，生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞凋亡。DEHP暴露也可改變生殖激素水平，導(dǎo)致血清中睪丸睪酮減少，精子死亡率和畸形率明顯增高。流行病學(xué)研究報道PAEs暴露可能導(dǎo)致男性生殖毒性[3-4]，子宮內(nèi)暴露DEHP可縮短雄性肛門生殖器距離[5]，并且在嚙齒類動物模型中的實驗也證實了這些發(fā)現(xiàn)[6]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，DEHP暴露致青春期Wistar大鼠睪丸生精小管嚴(yán)重萎縮，各級生精細(xì)胞減少；黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、睪酮(testosterone，T)、促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平顯著上升[7]。本實驗通過檢測DEHP對小鼠精原細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討DEHP對雄性生殖系統(tǒng)功能影響的毒作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細(xì)胞株

小鼠精原細(xì)胞(GC-1spd)，由北京協(xié)和基礎(chǔ)研究所分子生物學(xué)實驗室惠贈。

1.2 儀器與試劑

酶標(biāo)儀(MK3, Thermo公司，USA)，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur, BD公司，USA)，PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD, USA)，電泳儀(DYY-8C，北京六一醫(yī)學(xué)儀器廠)，紅外激光成像系統(tǒng)(Odyssey CLx, USA)。

DEHP(化學(xué)純，純度>99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，胰蛋白酶(gibco公司)，MTT(Amresco公司)，凋亡試劑盒(BD公司)，PCR試劑盒(上海生物工程有限公司)，Anti-Bax抗體(艾博抗上海貿(mào)易有限公司)，Anti-Bcl-2抗體(艾博抗上海貿(mào)易有限公司)，其余試劑均為市售分析純。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及DEHP溶液配制

將小鼠精原細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%，用0.25%胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min后傳代。

DEHP溶液配制：取原濃度為106mg·L-1的DEHP溶液100 μL，加入900 μL完全培養(yǎng)基，制成濃度為105mg·L-1的DEHP溶液，根據(jù)濃度梯度計算原則，依次配制1 000、100、10 mg·L-1的DEHP溶液。對照組為完全培養(yǎng)基。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞相對活力

將對數(shù)生長期小鼠精原細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后配制成密度為2×104cells·mL-1的細(xì)胞懸液，以每孔200 μL細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。換成DEHP終濃度為0、10、100、1 000 mg·L-1的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后。細(xì)胞處理并每孔加入20 μL的5 mg·mL-1MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，吸掉培養(yǎng)基，再加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)儀于490 nm處檢測各孔吸光度值(OD)，實驗重復(fù)3 次，計算其平均值，并按公式計算細(xì)胞相對活力。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞相對活力=(OD染毒組/OD對照組)×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

小鼠精原細(xì)胞經(jīng)DEHP染毒24 h后，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，離心棄上清，加入1×binding buffer 1 mL，再離心棄上清液，用1×binding buffer 100 μL反復(fù)吹打細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×106cells·mL-1。取細(xì)胞懸液100 μL至新的1.5 mL離心管，加入Annexin V-FITC和PI的混合液10 μL，輕彈混勻，室溫避光孵育15 min。轉(zhuǎn)移至新的流式玻璃管中，加入1×binding buffer 400 μL，輕彈混勻。在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)

細(xì)胞總RNA提取與cDNA合成按試劑盒說明書進(jìn)行。cDNA產(chǎn)物置-20 ℃保存。采用BIO-RAD型PCR儀，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行PCR。Bax基因引物序列，上游：5＇-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3＇，下游：5＇-CGTGTCCACGTCAGCAATCA-3＇；Bcl-2引物序列，上游：5＇-TGAAGCGGTCCGGTGGATA-3＇，下游：5＇-CAGCATTTGCAGAAGTCCTGTGA-3＇；Gapdh引物序列，上游：5＇-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3＇，下游：5＇-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3＇。反應(yīng)條件，95 ℃、 30 s，95 ℃、 3 s，60 ℃、 30 s，共40個循環(huán)。計算目的基因Bax和Bcl-2的相對表達(dá)量(relative quantification，RQ)。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，用裂解液提取細(xì)胞總蛋白，依據(jù)BCA法進(jìn)行蛋白定量，蛋白上樣量為50 μg，將電泳后分離的蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜上，5%的脫脂奶粉封閉，分別加Bax或Bcl-2兔抗鼠抗體，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次15 min。再加入鼠抗兔IgG抗體。室溫反應(yīng)1 h，TBST洗2次，TBS洗1次，每次10 min，以Tubulin作為內(nèi)參照，以紅外激光成像系統(tǒng)掃描并分析圖像，再計算相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 DEHP對細(xì)胞相對活力的影響

采用MTT比色法檢測不同濃度(0、10、100和1 000 mg·L-1)DEHP作用于小鼠精原細(xì)胞24 h后的細(xì)胞相對活力(圖1)。結(jié)果顯示(F=1 346.806，P=0.000)隨著DEHP暴露濃度增加，細(xì)胞相對活力呈下降趨勢，分別為100%、97.3%、77.9%和62.8%。其中1 000 mg·L-1劑量組明顯低于其他各劑量組，100 mg·L-1劑量組低于對照組和10 mg·L-1劑量組(P<0.05)。

圖1 DEHP對小鼠精原細(xì)胞相對活力變化注：*與對照組比較，P <0.05；◆與10 mg·L-1比較，P <0.05；?與100 mg·L-1比較，P <0.05。Fig. 1 Effect of DEHP on the relative activity of mouse spermatogoniaNote: *P <0.05 vs control group; ◆P <0.05 vs 10 mg·L-1; P<0.05 vs 100 mg·L-1.

2.2 DEHP對小鼠精原細(xì)胞的凋亡作用

如圖2、表1所示，小鼠精原細(xì)胞經(jīng)DEHP染毒24 h后，早期凋亡率1 000 mg·L-1劑量組高于對照組(P<0.05)；晚期凋亡率1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組均明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)；總凋亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，其中1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組還明顯高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)。

2.3 DEHP對小鼠精原細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響

小鼠精原細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA實時熒光定量PCR檢測結(jié)果見表2。Bax mRNA表達(dá)水平1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組與10 mg·L-1劑量組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表達(dá)水平1 000 mg·L-1劑量組低于10 mg·L-1劑量組和對照組(P<0.05)；此外，Bax和Bcl-2 mRNA比值1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組均明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)。

2.4 DEHP對小鼠精原細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)水平的影響

表3、圖3所示，在內(nèi)參表達(dá)一致的情況下，小鼠精原細(xì)胞經(jīng)不同濃度DEHP作用24 h后，Bax蛋白表達(dá)水平1 000 mg·L-1劑量組高于對照組(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)水平各劑量組與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，且1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯低于10 mg·L-1劑量組和對照組(P<0.05)；此外，Bax/Bcl-2兩蛋白間的比值關(guān)系是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，而1 000 mg·L-1劑量組高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)，隨著DEHP染毒劑量的增加，Bax/Bcl-2比值呈現(xiàn)上升趨勢。

表1 小鼠精原細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果Table 1 The apoptosis of mouse spermatogonia (±s)

注：*與對照組比較，P<0.05；◆與10 mg·L-1比較，P<0.05。

Note：*P<0.05 vs control group；◆P<0.05 vs 10 mg·L-1.

表2 小鼠精原細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)檢測結(jié)果Table 2 The Bax and Bcl-2 mRNA expression of the mouse spermatogonia (%) (±s)

注：*與對照組比較，P<0.05；◆與10 mg·L-1比較，P<0.05。

Note：*P<0.05 vs control group;◆P<0.05 vs 10 mg·L-1.

圖2 流式細(xì)胞儀檢測小鼠精原細(xì)胞凋亡注：O, 對照組；A, DEHP低劑量組；B, DEHP中劑量組；C, DEHP高劑量組。Fig. 2 The apoptosis of the mouse spermatogonia detected by flow cytometryNote: A, control; B, low-dose DEHP; C, medium-dose DEHP; D, high-dose DEHP.

圖3 小鼠精原細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白Western印記檢測注: O, 對照組；A, DEHP低劑量組；B, DEHP中劑量組；C, DEHP高劑量組。Fig. 3 Analysis of Bax and Bcl-2 protein expressions in the mouse spermatogonia detected by Western blotNote: O, control; A, low-dose DEHP; B, medium-dose DEHP; C, high-dose DEHP.

表3 DEHP染毒小鼠精原細(xì)胞24 h時Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)檢測結(jié)果(x±s)Table 3 The Bax and Bcl-2 protein expression of the mouse spermatogonia after 24 h exposure (x±s)

注：*與對照組比較，P<0.05；◆與10 mg·L-1比較，P<0.05。

Note：*P<0.05 vs control group;◆P<0.05 vs 10 mg·L-1.

3 討論(Discussion)

DEHP對人類和動物體的多種器官造成損傷作用，如影響肝臟、腎臟以及神經(jīng)系統(tǒng)，還可以降低機(jī)體的免疫功能，損害生殖腺，導(dǎo)致生殖器官畸形甚至癌變[8]?，F(xiàn)階段人們對DEHP的研究主要集中在生殖系統(tǒng)的體內(nèi)研究上，而對DEHP在生殖細(xì)胞上的研究較少，尤其對精原細(xì)胞的研究。為此本文探究了DEHP對小鼠精原細(xì)胞培養(yǎng)過程中的影響及毒性作用機(jī)制。

精原細(xì)胞在雄性生殖細(xì)胞早期發(fā)育階段具有無限分裂的能力，能在分裂過程中保持原有的基因性狀。再者，精子發(fā)生作為維持男性生育力高度復(fù)雜和關(guān)鍵的過程，又需要精原干細(xì)胞的連續(xù)自我更新和分化以及許多分子及途徑的參與才能進(jìn)行[9]，因此對精原細(xì)胞的研究是十分重要的。有研究認(rèn)為DEHP可直接損害精原細(xì)胞，減少細(xì)胞數(shù)量，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞死亡，發(fā)生性激素分泌紊亂，進(jìn)而降低雄激素水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。

有關(guān)DEHP的濃度選擇，經(jīng)過充分的預(yù)實驗證明，本實驗所選擇的暴露濃度具有實際意義。由于精原細(xì)胞對DEHP的接受程度和人體不一樣，且DEHP對精原細(xì)胞的染毒劑量目前在研究領(lǐng)域沒有明確規(guī)定，所以本實驗所選擇的實驗濃度對精原細(xì)胞是可行的。

本研究發(fā)現(xiàn)，DEHP對小鼠精原細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，隨著DEHP暴露劑量的增加，小鼠精原細(xì)胞的細(xì)胞相對活力1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組與對照組比較有顯著差異，主要表現(xiàn)在增殖現(xiàn)象明顯減少，小鼠精原細(xì)胞形成不明顯或形成后有明顯的細(xì)胞死亡和退化現(xiàn)象。特別是在1 000 mg·L-1劑量組的作用下，細(xì)胞數(shù)明顯減少。相比而言10 mg·L-1劑量組對小鼠精原細(xì)胞的影響較小，可繼續(xù)增殖，但出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞退化和死亡現(xiàn)象?？偟膩碚f，1 000 mg·L-1劑量組對細(xì)胞的影響較大，并隨著暴露時間的延長細(xì)胞損傷程度越明顯。楊電明[11]在對神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞的研究中也得出了和本文相一致的結(jié)論。Piche等[12]通過研究小鼠間質(zhì)腫瘤細(xì)胞系MA-10細(xì)胞的抗雄激素潛能時也發(fā)現(xiàn)，DEHP可降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖。還有研究發(fā)現(xiàn)：DEHP及其代謝產(chǎn)物MEHP可通過抑制PI3K/AKT細(xì)胞通路和阻礙信號傳導(dǎo)途徑影響精原細(xì)胞的增殖[13]。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致精原細(xì)胞數(shù)量減少的重要因素，精原細(xì)胞數(shù)量減少，勢必會阻礙精子的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，高劑量(1 500 mg·kg-1)組DEHP可使青春期SD雄性大鼠睪丸生精小管嚴(yán)重萎縮，各級生精細(xì)胞大量喪失，支持細(xì)胞呈空泡狀，間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生異常增生的現(xiàn)象，說明DEHP也可通過睪丸內(nèi)支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及各級生精細(xì)胞產(chǎn)生雄性生殖毒性作用[14]。本研究流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，隨著DEHP染毒劑量的增加，各劑量組小鼠精原細(xì)胞早期、晚期及總凋亡率呈逐漸上升趨勢，尤其是1 000 mg·L-1劑量組與對照組相比，凋亡率明顯升高(P<0.05)，說明1 000 mg·L-1劑量組對小鼠精原細(xì)胞的損傷最明顯。同時也說明DEHP能夠誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞凋亡的發(fā)生。宋曉峰等[15]發(fā)現(xiàn)，DEHP能誘導(dǎo)小鼠胚胎睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡，DEHP暴露組凋亡指數(shù)及凋亡細(xì)胞比例與對照組相比均有顯著差異(P<0.05)。還有研究發(fā)現(xiàn)，DEHP作用于青春期小鼠，可誘導(dǎo)其精子數(shù)量減少及生精上皮的組織學(xué)異常和減數(shù)分裂后生殖細(xì)胞的凋亡[16]。

細(xì)胞凋亡是由各種生理和病理刺激所引發(fā)的一種細(xì)胞死亡的獨特形式，且在機(jī)體生長發(fā)育和生殖衰老過程中發(fā)揮著重要的作用。導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的2個主要途徑之一是線粒體途徑，在該途徑活化期間特征性的生化變化是細(xì)胞色素C滲漏到細(xì)胞質(zhì)中[17]，這種從線粒體釋放的細(xì)胞色素C是由Bcl-2蛋白家族的成員調(diào)節(jié)，其中Bax和Bcl-2作為Bcl-2家族中的重要成員在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用[18]。

從實時熒光定量PCR結(jié)果可以看出，Bax mRNA的表達(dá)水平在DEHP染毒24 h后，1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，說明DEHP暴露能促使Bax mRNA 表達(dá)水平升高。相反Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平在DEHP暴露24 h后，1 000 mg·L-1劑量組明顯低于對照組和10 mg·L-1劑量組(P<0.05)；同時，Bax和Bcl-2 mRNA比值顯示，1 000 mg·L-1劑量組與對照組比較明顯上升(P<0.05)，表明DEHP對小鼠精原細(xì)胞的損傷具有一定的劑量依賴性，并隨著染毒劑量的增加Bax基因表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2基因表達(dá)減弱，從而誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡。吳維光等[19-20]得出DEHP對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞都具有毒性作用，且誘導(dǎo)凋亡機(jī)制與本文相同。有研究證明：低濃度的MEHP誘導(dǎo)Bax表達(dá)升高和促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，同時在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平降低Bcl-2的表達(dá)[21]。

細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的增加與減少是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要途徑。本研究顯示：DEHP暴露24 h后，隨著染毒劑量的增加，1 000 mg·L-1劑量組較對照組Bax蛋白表達(dá)有大幅升高趨勢，而1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組與對照組和10 mg·L-1劑量組比較Bcl-2蛋白表達(dá)水平均有降低的趨勢(P<0.05)，與Bax/Bcl-2蛋白比值中得出的結(jié)論一致，說明隨著DEHP染毒劑量的增加，Bax蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減弱?？梢娂?xì)胞凋亡確實受Bcl-2蛋白的調(diào)節(jié)，而且Bax/Bcl-2蛋白比值在細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Furuchi等[22]研究了轉(zhuǎn)基因小鼠精原細(xì)胞中Bcl-2蛋白的異常表達(dá)，證實小鼠精原細(xì)胞的凋亡是受Bcl-2蛋白的調(diào)節(jié)，與本文研究結(jié)論一致。

本實驗研究顯示，DEHP各劑量暴露組普遍引起小鼠精原細(xì)胞的損傷，且以高劑量組變化最為顯著，主要表現(xiàn)為細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著增加，進(jìn)而引起精子形成障礙等一系列生殖異常表現(xiàn)。而DEHP暴露后致使小鼠精原細(xì)胞內(nèi)Bax mRNA基因和促凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)上升，而Bcl-2 mRNA基因和抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)下降，改變了Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比值與平衡，是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素和主要機(jī)制。

[1] Markarian J. PVC additives- What lies ahead [J]. Plastics Additives and Compounding, 2007, 9(6): 22-25

[2] Chen L, Zhao Y, Li L, et al. Exposure assessment of phthalates in non-occupational populations in China [J]. Science of the Total Environment, 2012, 427-428(12): 60-69

[3] Wang Y X, Zeng Q, Sun Y, et al. Semen phthalate metabolites, semen quality parameters and serum reproductive hormones: A cross-sectional study in China [J]. Environmental Pollution, 2016, 211: 173-182

[4] Wang Y X, Zeng Q, Sun Y, et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China [J]. Environmental Research, 2016, 150: 557-565

[5] Swan S H, Main K M, Liu F, et al. Decrease in anogenital distance among male infants with prenatal phthalate exposure [J]. Environmental Health Perspectives, 2005, 113(8): 1056-1061

[6] Jr G L, Ostby J, Furr J, et al. Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat [J]. Toxicological Sciences, 2000, 58(2): 350-365

[7] 劉殊, 張敏, 徐肖倩, 等. DEHP染毒致青春期雄性大鼠的生殖毒性及維生素C、E的保護(hù)作用[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2016, 33(8): 780-784

Liu S, Zhang M, Xu X Q, et al. Reproductive toxicity induced by di(2-ethylhexy)phthalate in adolescent male rats and protective effects of vitamin C and vitamin E [J]. Environmental and Occupational Medicine, 2016, 33(8): 780-784 (in Chinese)

[8] 李劍, 徐飛, 李少旦, 等. 環(huán)境雌激素研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2006, 33(8): 1355-1359

Li J, Xu F, Li S D, et al. Advances in research on environmental estrogens [J]. Modern Preventive Medicine, 2006, 33(8): 1355-1359 (in Chinese)

[9] Sun J, Wang J, He L, et al. Knockdown of polycomb-group RING finger 6 modulates mouse male germ cell differentiationinvitro[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2015, 35: 339-352

[10] 楊俊杰. 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)及代謝產(chǎn)物鄰苯二酸-單-2-乙基己酯(MEHP)對幼鼠精原細(xì)胞影響的實驗研究[D]. 遵義: 遵義醫(yī)學(xué)院, 2011: 1-40

Yang J J. Experiment study of ethylhexyl phthalate (DEHP) and its metabolites (single-ethylhexyl phthalate, MEHP) influencing on spermatogonia in young male Wistar rats [D]. Zunyi: Zunyi Medical College, 2011: 1-40 (in Chinese)

[11] 楊電明. 鄰苯二甲酸酯對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞的毒性研究[D]. 西安: 陜西師范大學(xué), 2013: 1-40

Yang D M. Toxicity of phthalates to mouse neural stem cells and bone marrow stem cells [D]. Xi’an: Shaanxi Normal University, 2013: 1-40 (in Chinese)

[12] Piche C D, Sauvageau D, Vanlian M, et al. Effects of di(2-ethylhexyl)phthalate and four of its metabolites on steroidogenesis in MA-10 cells [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012, 79: 108-115

[13] Rothschild G, Sottas C M, Kissel H, et al. A role for kit receptor signaling in Leydig cell steroidogenesis [J]. Biology of Reproduction, 2003, 69(3): 925-932

[14] 秦逍云. 塑化劑DEHP對雄性動物的生殖毒性研究[D]. 深圳: 深圳大學(xué), 2015: 1-61

Qin X Y. The studying of effects of DEHP on male reproductive system [D]. Shenzhen：Shenzhen University, 2015: 1-61 (in Chinese)

[15] 宋曉峰, 張德迎, 鄧永繼, 等. 鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯誘導(dǎo)小鼠胚胎Leydig細(xì)胞凋亡的體外實驗研究[J]. 中華小兒外科雜志, 2007, 28(2): 69-72

Song X F, Zhang D Y, Deng Y J, et al. Apoptosis of Leydig cell induced by di(2-ethylhexyl)phthalateinvitro[J]. Chinese Journal of Pediatric Surgery, 2007, 28(2): 69-72 (in Chinese)

[16] Liu C, Qian P, Yang L, et al. Pubertal exposure to di(2-ethylhexyl)phthalate inhibits G9a-mediated histone methylation during spermatogenesis in mice [J]. Archives of Toxicology, 2016, 90(4): 1-15

[17] Liu X, Kim C N, Yang J, et al. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: Requirement for dATP and cytochrome c [J]. Cell, 1996, 86(1): 147-157

[18] 付永鋒, 樊廷俊. Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡[J]. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(英文), 2002(4): 389-394

Fu Y F, Fan Y J. Bcl-2 family proteins and apoptosis [J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2002(4): 389-394 (in Chinese)

[19] 吳維光, 葛紅雨, 韓建秋. DEHP體外影響大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bax和Bcl-2基因表達(dá)的實驗研究[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2013, 34(2): 160-163

Wu W G, Ge H Y, Han J Q. Effect of DEHP on Bax and Bcl-2 expressions in rat Leydig cellsinvitro[J]. Journal of Hebei Medical University, 2013, 34(2): 160-163 (in Chinese)

[20] 吳維光, 史海霞, 韓建秋, 等. DEHP體外對大鼠睪丸支持細(xì)胞Bax和Bcl-2基因表達(dá)的影響[J]. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2013, 35(1): 261-264

Wu W G, Shi H X, Han J Q, et al. Effect of DEHP on Bax and Bcl-2 expressions in rat Sertoli cellsinvitro[J]. Journal of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, 2013, 35(1): 261-264 (in Chinese)

[21] Ban J B, Fan X W, Huang Q, et al. Mono-(2-ethylhexyl)phthalate induces injury in human umbilical vein endothelial cells [J]. Plos One, 2014, 9(5): 1-9

[22] Furuchi T, Masuko K, Nishimune Y, et al. Inhibition of testicular germ cell apoptosis and differentiation in mice misexpressing Bcl-2 in spermatogonia [J]. Development, 1996, 122(6): 1703-1709