甲基異噻唑啉酮對斑馬魚胚胎的急性毒性和機制研究

呂鵬，吳巍，劉麗麗，張家禹，許雷，閆艷春

中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，生化與分子生物學實驗室，北京 100081

近年來，我國從歐洲引進了一種新型殺菌劑甲基異噻唑啉酮(methylisothiazolinone，MIT)，是異噻唑啉酮類衍生物，和其他同類衍生物相比毒性較弱[1-2]。MIT是一種高效、廣譜、藥效持久且相對安全的殺菌劑，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，如涂料、膠水、造紙業(yè)、橡膠、感光膠片及洗滌用品等[2-5]。優(yōu)點是有效用量少，極易混合在各類配方中，能很好地抑制微生物的生長，因此MIT被廣泛添加進化妝品和個人護理品制劑中，以延長保存期[1-3, 7-9]。生產(chǎn)的工業(yè)廢水、生活污水中大量MIT隨地下水循環(huán)系統(tǒng)等途徑進入環(huán)境水體中，已有研究者在污水口和河流中檢測到了相當量的MIT存在[8, 10-11]。盡管也有報道顯示MIT在水體中含量為ng·L-1級，且在自然環(huán)境中半衰期很短[11]，然而持續(xù)排放入水體而殘留下來的MIT是否危害水生生物的生存，影響水生生態(tài)的健康，需要進一步研究。

文獻報道，MIT對黑斑蛙胚胎的96 h-LC50和半數(shù)致畸濃度(96 h-TC50)分別為5.30 mg·L-1和2.36 mg·L-1，最小生長抑制濃度(MCIG)為2.59 mg·L-1，對蝌蚪的96 h-LC50為7.58 mg·L-1 [12]，對草魚肝臟腎臟器官的細胞，在48 h后，溫度分別為15 ℃和25 ℃下的LC50范圍為0.53 mg·L-1和0.41 mg·L-1[13]，對鹵蟲無節(jié)幼體96 h-LC50為10.4 mg·L-1 [14]。還有研究表明MIT對小鼠表皮和呼吸系統(tǒng)的免疫應(yīng)答有強烈刺激作用，接觸2.5%的MIT處理液就能引起小鼠皮膚過敏反應(yīng)和刺激性皮膚炎[15-16]。隨著異噻唑啉酮類其他衍生物控制力度的加大，使異噻唑啉酮類物質(zhì)的危害淡出了人們的視線，且MIT對魚類毒性數(shù)據(jù)還很欠缺，所以對于水體中殘留的MIT對魚類的影響評價不足。但是MIT作為目前最廣泛使用的異噻唑啉酮類物質(zhì)，其在水中殘留和對魚類的威脅也應(yīng)該引起重視[7,9,15]。

斑馬魚作為毒理學模式動物，具有遺傳背景清晰，體型小，產(chǎn)卵量大，胚胎發(fā)育迅速，早期透明，可清晰看到發(fā)育各階段，便于觀察和顯微操作等特點。斑馬魚胚胎也廣泛應(yīng)用于急性毒性實驗中，評價各種化學物質(zhì)的毒性作用[17-20]。本研究以斑馬魚胚胎為模型，根據(jù)OECD實驗標準(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals)[21]，進行急性毒性實驗，評價MIT對斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)，為MIT的環(huán)境污染管控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

AB品系斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center, CZRC)。

儀器設(shè)備：斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(愛生科技發(fā)展有限公司，北京)；雷磁PHS-3D型pH計(精密科學儀器有限公司，上海)；電導度測試儀(哈納公司，意大利)；BPC-250 F型生化培養(yǎng)箱(一恒科學儀器有限公司，上海)；熒光顯微鏡X83(奧林巴斯，日本)；Heal Force超純水系統(tǒng)(力康集團，香港)；一次性吸管和培養(yǎng)皿(康健華醫(yī)療用品有限公司，江蘇)；塑料六孔細胞培養(yǎng)板(耐思生物科技有限公司，無錫)；精密型pH試紙(sigma公司，美國)。

試劑藥品：甲基異噻唑啉酮(MIT, CAS NO: 2682-20-4; 99%，百靈威，中國)；吖啶橙(acridine orange, CAS: 10127-02-3，索萊寶，中國)；霉鏈蛋白酶(protease，CAS: 37259-58-8, Qiagen公司，德國)；三卡因甲磺酸鹽麻醉劑(tricaine methanesulfonate, TMS, CAS: 886-86-2, Sigma公司，美國)；氯化鈉、碳酸氫鈉等化學藥品均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗生物

斑馬魚的養(yǎng)殖方法：實驗用AB品系斑馬魚在自動水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行飼養(yǎng)，系統(tǒng)自動維持養(yǎng)魚水的電導度在500～550 μS·cm-1之間，pH 為7.0～7.5，溶解氧>6.0 mg·L-1，水溫控制在(28±0.5) ℃，飼養(yǎng)環(huán)境光周期為光:暗=14 h:10 h。每天喂食新鮮豐年蟲幼蟲2～3次，幼蟲由豐年蟲卵(Aquamaster公司，中國臺灣)孵化得到。孵化時，將豐年蟲卵放于25 g·L-1氯化鈉溶液中，水溫(28±0.5) ℃，持續(xù)通氣，連續(xù)光照32 h即可孵化，收集幼蟲后去除雜質(zhì)并用清水洗去過多鹽分，可短期存放于4 ℃冰箱，或于-20 ℃下凍存[22]。

斑馬魚胚胎的收集方法：于前一天晚上將成年種魚按照雌雄比例2:2裝入交配盒中，并用隔板將雌雄魚分開。第2天早上光照開始時(10 h后)將隔板抽出，待雌雄魚追尾交配30 min后收集發(fā)育時期一致的健康胚胎[18, 24-25]。將收集到的胚胎混合均勻，換干凈的養(yǎng)魚水于培養(yǎng)皿中，作實驗材料。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚胚胎毒性實驗

為保證對照組胚胎死亡率小于5%，排除未受精及異常胚胎對毒性評價的干擾，本實驗選擇在受精后3 h (3 hours post-fertilization，3 hpf)開始暴露染毒。收集到胚胎3 h后，去除異常和死胚，并在倒置顯微鏡下挑出正常分裂的胚胎。MIT濃度范圍根據(jù)預實驗結(jié)果設(shè)置，將提前配制的1.0 g·L-1MIT儲備液用養(yǎng)魚水依次稀釋到1.52、3.71、5.43、7.12、9.48 mg·L-1，包含1個對照組，各制備500 mL處理液(避光保存)。每個處理組包含3個生物學重復，20個胚胎為一個重復。實驗在6孔板中進行，每孔加入10個健康的3 hpf胚胎，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的處理液10 mL，對照組加入等體積養(yǎng)魚水。采用半靜態(tài)方式進行暴露處理，將培養(yǎng)皿置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，暴露總時間為96 h(即從3 hpf～99 hpf)，培養(yǎng)箱孵化溫度為(28±0.5) ℃，處理液pH維持在7.0，電導率約510 μs·cm-1，溶氧量>6 mg·L-1，保持胚胎處理過程中光:暗=14 h:10 h。本實驗處理條件比較穩(wěn)定，預實驗中對處理液監(jiān)測和高效液相色譜分析結(jié)果顯示，換水前后處理液性質(zhì)和MIT濃度保持恒定，所以采用換水式對斑馬魚胚胎進行毒性實驗[18-19, 24]，即每24小時更換一次處理液，及時挑出死亡的胚胎。每24小時對斑馬魚胚胎進行一次鏡檢觀察，測量不同時期的各項生理指標和死亡、畸形等數(shù)據(jù)，進行記錄。

1.3.2 細胞凋亡吖啶橙染色

吖啶橙染色用于檢測細胞凋亡情況，實驗流程參照文獻[20, 25]。

具體方法為：選取半致死濃度1/10左右的濃度作為處理起始濃度，依次設(shè)置MIT濃度為0.5 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1。處理72 h后，收集存活胚胎，用養(yǎng)魚水清洗2～3次后，對沒脫膜的胚胎使用5 mg·mL-1鏈蛋白酶在25 ℃下脫膜2 min，再用養(yǎng)魚水清洗2～3次，顯微鏡下選出存活、完整的胚胎放于培養(yǎng)皿中，以備染色。

染色方法：將提前配好的吖啶橙1 g·L-1儲備液用養(yǎng)魚水稀釋到2 mg·L-1，將脫膜后的胚胎轉(zhuǎn)移到2 mg·L-1的吖啶橙溶液中，避光染色30～60 min，定時觀察，當胚胎出現(xiàn)死亡時可以終止染色。染色終止后用養(yǎng)魚水潤洗胚胎2～3次。清洗完畢后，使用0.1 g·L-1Tricaine麻醉劑處理5～10 min。待胚胎麻醉，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，所有照片拍攝條件均相同，觀察帶有黃綠色熒光標記的凋亡細胞。

1.3.3 統(tǒng)計分析

在急性毒性實驗過程中，每24小時記錄一次胚胎死亡數(shù)，24 h時記錄胚胎自主抽動次數(shù)，48 h后統(tǒng)計孵化胚胎數(shù)，96 h后統(tǒng)計存活的幼魚數(shù)量，以及存活胚胎的畸形數(shù)，并在顯微鏡下觀察畸形狀況，測量正常幼魚72 h時的心率、96 h體長等生理特征，并分析胚胎-幼魚運動、反應(yīng)等行為學特征。

毒理學數(shù)據(jù)統(tǒng)計：斑馬魚胚胎的孵化從48 hpf開始，本實驗統(tǒng)計處理后48 h(51 hpf)胚胎的孵化率。并以處理濃度為自變量x，胚胎孵化率為因變量y，使用SPSS 22軟件，用單因素方差分析(one-way ANOVA)法分析處理組和對照組之間孵化率差異的顯著性。采用Origin Pro 15軟件處理96 h死亡率和畸形率數(shù)據(jù)，由logistic非線性回歸分析，得到“劑量-效應(yīng)”曲線方程，計算MIT的96 h-LC50和96 h-TC50及95%的置信區(qū)間。

形態(tài)和生理特征分析：選取72 h存活的幼魚，在體視顯微鏡下統(tǒng)計胚胎心率，處理到96 h后觀察幼魚運動行為和應(yīng)激反應(yīng)情況，用0.1 g·L-1Tricaine麻醉劑處理5～10 min，每個處理組測量30個胚胎的體長，取平均值，使用SPSS 22中的T檢驗分析其最小生長抑制濃度和最低毒性效應(yīng)劑量。

吖啶橙染色分析：選取不同角度，將處理組圖片與對照組進行比對，找到凋亡細胞差異區(qū)域，排除本底熒光的干擾，分析處理組中凋亡細胞富集的范圍，從而判斷MIT的毒性作用區(qū)域。

2 結(jié)果(Results)

2.1 斑馬魚胚胎毒性實驗

2.1.1 MIT對胚胎孵化率的影響

MIT處理液暴露48 h時，對斑馬魚胚胎的孵化率進行了統(tǒng)計。研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的MIT對胚胎孵化就有抑制作用，在梯度濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg·L-1)的MIT處理下，孵化率隨濃度增大而降低。對照組孵化率為31.96%，MIT濃度大于1.0 mg·L-1時，孵化率顯著下降，當濃度大于4.0 mg·L-1后，孵化率低于15%，使用SPSS 22軟件進行單因素方差分析((one-way ANOVA)，得到不同處理濃度下孵化率之間差異顯著性(圖1所示)。

圖1 甲基異噻唑啉酮(MIT)處理48 h后對胚胎孵化率的影響注：A. MIT不同濃度處理組胚胎孵化率，數(shù)據(jù)表示為平均值±SE(n = 3, 每個生物重復20個胚胎)，差異顯著性用星號表示， *P<0.05， ** P<0.01, *** P<0.001；B. 孵化胚胎占存活胚胎的比例。Fig. 1 Effects of methylisothiazolinone (MIT) on hatching rate after 48 h exposure Note: A. Hatching rate at different concentration of MIT， values are presented as mean ± SEM (n = 3, 20 embryos in each replicate); * P < 0.05, ** P < 0.01; *** P < 0.001; B. Percentage of hatched embryos in survival embryos.

圖2 MIT在72 h和96 h時對斑馬魚胚胎的致死率統(tǒng)計注：A. 致死率隨濃度和處理時間遞增，B. 96 h致死率logistic擬合，R2為0.9988(3個平行試驗，n=3)。Fig. 2 Mortality of zebrafish embryos exposed to MIT after 72 h and 96 hNote: A. Mortality increased with time and concentration increasing; B. logistic nonlinear fitting of 96 h mortality, R2=0.9988 (three parallel tests, n=3).

圖3 MIT的致畸效應(yīng) 注：A為96 h發(fā)育正常的幼魚; B為體軸向內(nèi)彎曲(1)和尾部畸形(2); C為體軸向外彎曲(1)；D為心包囊腫和卵黃囊水腫；E為尾部發(fā)育不良；F為發(fā)育遲緩胚胎的畸形胚胎。Fig. 3 Teratogenesis effect of MITNote: A. normal control; B. body axon incurve (1) and tail dysmorphia (2); C. body axon outcurve (1); D. pericardial edema and yolk edema; E. tail dysontogenesis; F. embryos developmental retardation.

2.1.2 MIT對胚胎死亡率的影響

根據(jù)預實驗結(jié)果，確定急性毒性實驗MIT處理組濃度范圍為1.52～9.48 mg·L-1。48 h前未孵化胚胎的死亡率比較低，到72 h后處理組胚胎開始出現(xiàn)死亡，且隨處理濃度遞增，到96 h后，9.48 mg·L-1濃度下幼魚全部死亡。對死亡率進行l(wèi)ogistic非線性擬合，呈S型“效應(yīng)-劑量”曲線，根據(jù)擬合方程得到96 h-LC50為6.15 mg·L-1，95%置信區(qū)間為(4.97, 7.34)，對魚類高毒，其安全濃度采用通用算法：96 h-LC50×0.01=0.06 mg·L-1(圖2所示)。

2.1.3 MIT對胚胎畸形率的影響

MIT處理96 h后，使用奧林巴斯IX 83顯微鏡觀察斑馬魚形態(tài)以及運動特征，統(tǒng)計孵出幼魚中畸形個體數(shù)。觀察發(fā)現(xiàn)MIT引起3種主要的畸形形態(tài)：體軸彎曲(包含尾部彎曲)、心包水腫和卵黃囊水腫(圖3所示)，3種畸形中，體軸彎曲的個體占大多數(shù)?；温孰SMIT處理濃度梯度提高而升高，在較低濃度時就有明顯的致畸效應(yīng)，1.0 mg·L-1的濃度下畸形率就達到了18.4%，可見MIT對胚胎發(fā)育有很大影響。統(tǒng)計得到96 h畸形率后，通過Origin Pro 15進行非線性擬合分析。得到96 h-TC50為3.89 mg·L-1，95%置信區(qū)間為(2.96, 4.82)(圖4所示)。

2.1.4 MIT對斑馬魚胚胎生理特性的影響

經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MIT對斑馬魚生長具有抑制作用，主要體現(xiàn)在幼魚心率的降低和體長縮短。在MIT梯度濃度暴露下，72 h時不同處理組斑馬魚幼魚心率隨處理濃度提高而降低，對照組中幼魚心臟搏動有力，平均心房率為(175±4) beats·min-1，處理濃度達到1.52 mg·L-1時，心率與對照組相比顯著下降(表3所示)。測量96 h幼魚體長數(shù)據(jù)顯示，濃度大于2.31 mg·L-1的處理組中胚幼魚長與對照組存在顯著差異，顯著性分析可判斷MIT對斑馬魚幼魚生長的最小抑制濃度(MCIG)為2.31 mg·L-1(表4所示)。

圖4 MIT對斑馬魚幼魚96 h的致畸率以及96 h致畸率logistic擬合注：A為致畸率隨濃度升高顯著增大，B為96 h時3個平行實驗擬合，R2為0.9933。Fig. 4 Zebrafish embryo deformity exposed to MIT after 96 h and its logistic nonlinear fittingNote: A, Increase of deformity with the increase of MIT concentration; B, Three parallel experiments fitting, R2=0.9933.

表4 MIT 96 h暴露對斑馬魚幼魚體長的影響Table 4 Effects of MIT on the body length of zebrafish larvae after 96 h exposure

注：*表示處理組與對照組相比存在顯著差異(P<0.05)。

Note：*Indicates significant difference between exposed groups and the control group (P< 0.05)．

圖5 MIT暴露下細胞凋亡分析注：在MIT暴露72 h后，對斑馬魚胚胎進行吖啶橙染色；(A)和(B)為對照組和0.25 mg·L-1處理組，沒有凋亡細胞；(C)和(D)為1.0 mg·L-1處理組，在尾部有大量凋亡細胞存在；(E)和(F)為1.0 mg·L-1的處理組，觀察到有大量凋亡細胞存在于腦部；(G)和(H)為2.0 mg·L-1處理組，有大量凋亡細胞分布在腦部和鰓部。圖中用白色箭頭標記凋亡細胞分布。Fig. 5 MIT-induced apoptosis analysis Note: After exposure to MIT for 72 h, the zebrafish embryos were stained with acridine orange (AO); (A) and (B), No apoptotic cells were observed in the control and 0.25 mg·L-1 MIT treated groups; (C) and (D), A large number of apoptotic cells were observed in tail in the 1.0 mg·L-1 MIT treated groups; (E) and (F), A small area of apoptotic cells were observed in the brain in the 1.0 mg·L-1 MIT treated groups; (G) and (H), In 2.0 mg·L-1 groups, a lot of apoptotic cells were observed in gill and brain. Apoptotic cells were indicated by white arrowheads.

2.2 細胞凋亡AO染色

AO染色檢測MIT暴露下胚胎細胞凋亡情況，MIT梯度暴露濃度為0.25、0.75、1.0、2.0 mg·L-1，72 h的暴露胚胎脫膜后染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和0.25 mg·L-1的處理組中沒有明顯的凋亡細胞群體，當處理濃度達到1.0和2.0 mg·L-1后，能夠在高倍鏡下觀察到凋亡細胞，主要出現(xiàn)在胚胎腦部和尾部(圖5所示)。

3 討論(Discussion)

由于個人護理產(chǎn)品、日用品和涂料在生活中無處不在，而且近年來一些由這些物品導致的過敏、疾病，使人們開始關(guān)注其中防腐劑的危害。甲基異噻唑啉酮是其中使用最廣泛的防腐劑和抗菌劑，隨著國際社會對MIT毒性的逐漸認識，對其毒性評價也開始逐漸開展。

本文首次研究了MIT對斑馬魚胚胎的急性毒性，根據(jù)高效液相色譜分析，在實驗條件下，72 h內(nèi)處理液中MIT濃度和性質(zhì)都能保持穩(wěn)定[6]。MIT對胚胎孵化有很強的抑制作用，當濃度大于等于1.0 mg·L-1時，就能顯著抑制胚胎孵化，不能順利孵化的胚胎在96 h后全部死亡，藥物可能對胚胎早期發(fā)育相關(guān)基因或?qū)ε咛ピ缙谏泶x有影響，導致胚胎發(fā)育后期孵化酶分泌和活性降低而不能分解卵殼，暴露可能干擾了孵化酶的結(jié)構(gòu)和功能，具體的抑制機理有待于進一步研究[26-27]。暴露濃度為1.52 mg·L-1時，96 h后幼魚的死亡率明顯上升，當濃度達到9.48 mg·L-1時96 h幼魚全部死亡，得到了MIT對斑馬魚胚胎96 h的半致死濃度為6.15 mg·L-1，這對水生生物而言是高毒。暴露濃度為0.5 mg·L-1時畸形胚胎數(shù)量相比對照組顯著增多，暴露的胚胎在96 h的半致畸濃度為3.89 mg·L-1。同時，統(tǒng)計MIT暴露96 h的幼魚體長數(shù)據(jù)后，得到了最小生長抑制濃度為2.31 mg·L-1，值得注意的是，在2.31 mg·L-1的濃度下，多數(shù)胚胎都已產(chǎn)生畸形。與骨骼發(fā)育相關(guān)的畸形，如體軸彎曲占畸形比率較大，而且幼魚體長顯著變化。一方面，MIT暴露干擾了Wnt、Notch和Tgf-8等信號通路，影響胚胎靶器官的發(fā)育；另一方面可能是通過干擾發(fā)育重要基因的表達調(diào)控，如nbtps、nkx2.5和tbxl6等，進而影響隨后的胚胎靶器官的發(fā)育，從而導致胚胎畸形發(fā)育[19,24]。在對胚胎生理特性和行為觀察中發(fā)現(xiàn)，暴露于1.52 mg·L-1以上濃度的MIT就能使胚胎心率顯著降低，心率降低在某種程度上也體現(xiàn)了MIT的心臟毒性[28-29]。關(guān)于斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究表明，24 h后胚胎神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)基本發(fā)育成熟，自主抽動次數(shù)小于等于1次[30-31]，實驗觀察到MIT濃度大于1.52 mg·L-1的暴露組，24 h胚胎每分鐘自主抽動次數(shù)大于1次，表明神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育受到影響。進一步觀察72 h和96 h幼魚的行為，發(fā)現(xiàn)MIT濃度大于1.52 mg·L-1的暴露組胚胎自主活動能力下降，且觸碰反應(yīng)遲鈍，這表明它們的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受到了影響[31-34]。綜上所述，實驗中大量數(shù)據(jù)和現(xiàn)象都表明，MIT對斑馬魚胚胎產(chǎn)生了比較顯著的毒性作用，包括孵化抑制、致畸性、發(fā)育抑制、心臟毒性、神經(jīng)毒性，充分說明MIT對水生物的毒害作用不容忽視，同時也為毒性機理的研究提供了依據(jù)。

本研究顯示MIT對斑馬魚胚胎具有高毒，由此看來MIT對水生生物的毒性已經(jīng)不容忽視。MIT主要通過污水排放系統(tǒng)進入環(huán)境中，廣泛分布于地表水中，環(huán)境監(jiān)測一般水體中MIT含量通常在ng·L-1，而在污水排放口附近的河流處含量為μg·L-1[8,11]。MIT在環(huán)境中的降解主要受光照、溫度、pH、金屬離子、溶液介質(zhì)等因素的影響，有研究表明，光照、堿性、含鐵離子和強親核試劑，如硫化物的溶液能顯著加速異噻唑啉酮的光降解[35]。這些都導致了MIT的環(huán)境濃度遠低于實驗中的毒性效應(yīng)濃度，但在局部水環(huán)境中也會有過量MIT，且長期暴露于MIT污染的環(huán)境中，也可能在生物體中富集，且根據(jù)安全系數(shù)分析，長期暴露于低濃度MIT下也會對魚類產(chǎn)生不良影響[36]。

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