碳納米材料的水環(huán)境行為及對水生生物毒理學(xué)研究進展

李佳昕，張嫻，張愛清，常雪靈

1. 中南民族大學(xué)，武漢 430071 2. 中國科學(xué)院環(huán)境與健康重點實驗室，中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，廈門 361021 3. 中國科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性實驗室，中國科學(xué)院高能物理研究所，北京 100049

碳納米材料是由碳元素組成，至少有一個維度在納米尺度的新型納米材料，主要包括富勒烯(fullerene)、碳納米管(carbon nanotubes)和石墨烯(graphene)。近10年來，碳納米材料的諸多優(yōu)勢使其用于導(dǎo)電材料、光學(xué)器件、量子計算機領(lǐng)域，并在生物污染修復(fù)、分子開關(guān)、組織工程學(xué)、制藥、醫(yī)學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用[1-5]。隨著碳納米材料使用增多，不可避免地從環(huán)境中擴散到水體、土壤和大氣等介質(zhì)并在其中沉積下來[6-8]，所以在生態(tài)系統(tǒng)中，每一個環(huán)節(jié)都有可能有碳納米材料的暴露并積累，而水環(huán)境與水生生物和人類關(guān)系最為密切，所以其影響備受關(guān)注。圖1總結(jié)了碳納米顆粒在環(huán)境中可能的分布行為和傳播途徑[9]。

大量研究表明，碳納米顆粒能穿過細胞壁、細胞膜從而進入生命體的任何細胞，引發(fā)生物體肺部腫瘤和細胞炎癥等反應(yīng)，對生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng)，而且它們很可能沿著食物鏈傳遞并累積[10-11]。另外，碳納米材料脂溶性強，水中溶解度低，是現(xiàn)今最難生物降解的人工合成材料之一。雖然目前在水體中測到的碳納米材料濃度非常低[12]，它們對自然環(huán)境和生物健康的危害沒有完全暴露出來，但是隨著碳納米材料的大量生產(chǎn)和使用，其進入水環(huán)境中的機會越來越多。因此，對碳納米材料的水環(huán)境行為與水生生物的毒性效應(yīng)研究已然迫在眉睫[13-14]。本文總結(jié)了關(guān)于碳納米材料在水環(huán)境中的行為、對水生生物毒性效應(yīng)及其毒性機理等方面的研究進展，為研究碳納米材料對環(huán)境的影響提供客觀依據(jù)，并對今后的研究方向作出展望。

1 碳納米材料的分類、特性及應(yīng)用(Classification, characteristics and application of carbon nanomaterials)

碳納米材料根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可將其主要分為富勒烯、碳納米管和石墨烯。其分類、制備方法、特征和用途見下表1。

富勒烯是由多個碳原子構(gòu)成的空心球狀體(表1a)，其單體含60個碳原子，因此富勒烯也稱C60。人類在1985年首次發(fā)現(xiàn)了富勒烯，其是由60個碳原子連接而成的32面空心球體，直徑0.71 nm，其包含了12個五圓環(huán)和20個六圓環(huán)，因外形酷似足球，所以也被稱為足球烯[15]。

碳納米管(CNTs)單體是由石墨片卷曲形成的圓柱型管狀體，根據(jù)不同的石墨片層數(shù)，可以分為單壁碳納米管，簡稱SWCNTs(圖2b)和多壁碳納米管，簡稱MWCNTs(圖2c)。理想碳納米管是由碳原子形成的石墨烯片層卷曲而成的無縫、中空的管體，且構(gòu)成CNTs的片層之間存在一定的夾角，由于其獨特的結(jié)構(gòu)，CNTs具有很多其他納米材料不具備的特殊性能——高彈性、高強度、低密度、良好的紅外吸收性及強疏水性等優(yōu)點。根據(jù)SWCNTs的卷曲向量不同，又可以表現(xiàn)出金屬性或半導(dǎo)體性這2種不同特性[17]。利用CNTs的特殊性質(zhì)，我們可以制作出大量性能優(yōu)異的復(fù)合材料，如CNTs增強的陶瓷復(fù)合材料和CNTs增強的塑料。另外據(jù)理論推算，CNTs的可逆儲/放氫量在5 wt%左右，是迄今為止最好的儲氫材料[18]。

圖1 納米材料生態(tài)環(huán)境行為示意圖[9]注：圖中黑圓點代表碳納米材料，數(shù)字代表其各種環(huán)境過程；①大氣與地表間的交換②大氣輸送③土壤中遷移擴散和滲透④土壤中轉(zhuǎn)化 ⑤陸生生物吸收富集⑥地下水中遷移和轉(zhuǎn)化⑦地表徑流⑧水體與土壤間交換⑨水中分散與懸浮 ⑩水中團聚與沉淀水體中轉(zhuǎn)化水生生物吸收富集人體暴露。Fig. 1 Ecological behavior of nanomaterials[9]Note: black dot represents carbon nanomaterials; ① exchange between atmosphere and earth surface, ② atmospheric transport, ③migration, distribution and permeation in soil, ④ transformation in soil, ⑤ absorption and accumulation by terrestrial organisms, ⑥ migration and transformation in ground water, ⑦ surface runoff, ⑧ exchange between waters and soil, ⑨ distribution and suspension in water, ⑩ agglomeration and precipitation in water, transformation in water, absorption and accumulation by aquatic organisms, human exposure.

石墨烯又稱單層石墨(圖2d)，是一種蜂窩狀二維平面結(jié)構(gòu)，其軌道雜化模式為sp3雜化，同時具有金屬和半導(dǎo)體的一些特性。石墨烯具有獨特的機械、熱力學(xué)、電學(xué)特性，與此同時，它還具有獨特而優(yōu)異的理化性能[19]。與碳納米管一樣，石墨烯在柔性透明導(dǎo)電材料、場發(fā)射、場效應(yīng)晶體管器件、超級電容器、太陽能電池、儲氫儲能材料、傳感器、復(fù)合材料、生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用等眾多方向具有巨大的潛在應(yīng)用前景[20]。

2 碳納米材料在水環(huán)境中的行為(Behavior of carbon nanomaterials in aquatic environment)

2.1 碳納米材料在水環(huán)境中的穩(wěn)定性及影響因素

在水環(huán)境中，碳納米材料溶解度低，屬于疏水性，會發(fā)生懸浮、聚沉和再懸浮等行為[21]。碳納米材料的分散和聚集除了與自身性質(zhì)密切相關(guān)，也與水體環(huán)境，如pH、水溶液的離子強度、表面活性劑和溶解性有機質(zhì)等因素有關(guān)。其在水環(huán)境中的分散和聚集性能極大地影響其遷移歸趨等環(huán)境行為[22]。

2.1.1 C60的水環(huán)境行為

表1 單質(zhì)碳納米材料(a.富勒烯b. 單壁碳納米管 c. 多壁碳納米管 d.石墨烯)Table 1 Carbon nanomaterials (a. Fullerenes b. SWCNT c. MWCNTs d. Graphene )

C60在水中的溶解度很小，基本不溶或微溶于其他極性溶劑，但C60在水中會以膠態(tài)聚集體的形式穩(wěn)定存在[23-26]。有研究表明，隨著pH上升，C60納米材料的粒徑先快速減小然后趨于穩(wěn)定，表面zeta電位增大，隨電解質(zhì)濃度的增加，C60納米材料粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢且zeta電位減小。在水溶液中，表面活性劑會形成泡狀溶液或者膠束溶液，這會大大增加C60的溶解度[27]。如C60可以在表面活性劑曲拉通X-100形成的膠束溶液中穩(wěn)定分散[28]。長時間攪拌水中C60所形成的膠態(tài)C60懸浮液與利用有機溶劑法生成的膠態(tài)C60懸浮液的穩(wěn)定性和聚集狀態(tài)存在很大差異[28]。腐殖酸可以提高C60在水中的穩(wěn)定性[29]，膠態(tài)C60的分散和聚集性能與有機大分子的性質(zhì)息息相關(guān)，由于電荷穩(wěn)定以及原子排列空間位阻作用，富里酸、腐殖酸、蛋白質(zhì)和丹寧酸具有減弱C60材料聚集和沉降的傾向；而由于架橋作用，多聚糖一般會促進C60沉降和聚集[28]。

2.1.2 CNTs的水環(huán)境行為

因為沿CNTs長軸方向范德華力很強，CNTs同樣也具有很強的疏水性[30-31]。在特定環(huán)境條件下，CNTs會在水溶液中以懸浮狀態(tài)穩(wěn)定存在。如添加陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑以及非離子表面活性劑等都可以使CNTs在溶液中穩(wěn)定懸浮[32]。其原因是表面活性劑可以增大其表面積使得CNTs在水溶液中更容易分散。另一方面，加入表面活性劑不僅使水溶液形成適宜的熱動力學(xué)表面，而且由于CNTs間的靜電斥力和空間位阻等相互作用，阻礙CNTs發(fā)生聚集[31]。水體環(huán)境中的溶解性有機質(zhì)與CNTs結(jié)合后，也會提高溶液中CNTs的穩(wěn)定性。Hyung等[30]研究發(fā)現(xiàn)，天然有機大分子與表面活性劑相比，可以更好地使MWCNTs單體穩(wěn)定懸浮，當(dāng)溶解性天然有機大分子與十二烷基硫酸鈉溶液質(zhì)量濃度比為1:100時所能懸浮的MWCNTs單體比例約為3:1。同時，Hyung等[30]還發(fā)現(xiàn)，腐殖酸可以提高MWCNTs在去離子水中的溶解平衡濃度。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)多聚糖、蛋白質(zhì)、丹寧酸和其他高聚物會通過非共價修飾作用，增大CNTs在水溶液中的溶解性[33-34]。

2.1.3 石墨烯的水環(huán)境行為

石墨烯在水中的溶解度極低，因范德華力作用，其在水溶液中易形成團聚體，甚至堆積形成石墨[35]。氧化石墨烯(GO)表面具有親水性含氧官能團，因此其較容易在水溶液中均勻分散。同時，由于靜電穩(wěn)定機制，GO在水中容易形成穩(wěn)定的膠體溶液。石墨烯表面的zeta電位受溶液pH影響，進而顆粒間的相互作用也會受到影響，因此而改變了石墨烯的懸浮狀態(tài)。Lanphere等[36-37]研究表明， 5

2.2 碳納米材料在多孔介質(zhì)中的傳輸

碳納米材料在多孔介質(zhì)中的轉(zhuǎn)運特征是碳納米材料在地下含水層中遷移歸趨以及環(huán)境生態(tài)風(fēng)險的重要組成部分[38-39]。由于擴散、截留以及沉積作用，碳納米材料會因為附著在多孔介質(zhì)表面或者被包裹其中而被去除。改變物理化學(xué)條件(如pH值、離子強度、流速等)后，碳納米材料可能重新懸浮并進入水體中。C60和CNTs均為疏水性碳納米材料，可以通過人為修飾以及環(huán)境作用發(fā)生衍生化，增加其親水性，相應(yīng)地就會使附著效率降低，遷移性能增加。Lecoanet等[38]發(fā)現(xiàn)，水溶性的羥基富勒烯以及SWCNTs在多孔介質(zhì)中遷移能力比膠態(tài)C60強，相比之下，前兩者的穿透速率更快、穿透率更高。多孔介質(zhì)中碳納米材料的轉(zhuǎn)運也會受水流流速的影響，雖然羥基富勒烯、SWCNTs和膠態(tài)C60的表面化學(xué)和材料大小存在很大差異，但在較高的水流流速下，三者的穿透曲線極其相似。Cheng等[40]研究了水溶性膠態(tài)C60在土柱中的遷移。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速設(shè)計為典型地下水流速0.38 m·d-1時，膠態(tài)C60的穿透率僅為60%，此時，其遷移性能較弱，易于沉降。另外，有研究證實多孔介質(zhì)中膠態(tài)C60的運移以及沉降性能也會受電解質(zhì)組成和濃度、有機大分子以及膠態(tài)C60不同制備方法等各方面的影響[28]。

Lanphere等[36]研究了溶液理化條件對GO在飽和石英砂柱中遷移的影響，發(fā)現(xiàn)GO在水環(huán)境中的遷移行為受pH影響并不明顯，而離子強度才是影響GO在多孔介質(zhì)中遷移的決定因素。當(dāng)離子強度較高時，GO的團聚作用以及其與石英砂表面的相互作用增強，在飽和多孔介質(zhì)中GO的遷移能力降低。Feriancikova等[41]對GO在飽和砂柱中研究也得到了相似的結(jié)果。Chowdhury等[42]在研究硅砂與GO的相互作用過程中，發(fā)現(xiàn)在不同鹽溶液中保留在硅砂中的GO的釋放程度不同，但無論是什么溶液，GO在硅砂中的沉積都會隨離子強度的增加而增大。

2.3 碳納米材料在水環(huán)境中的轉(zhuǎn)化與降解

目前關(guān)于石墨烯的制備純化過程還不完善，其降解轉(zhuǎn)化相關(guān)的研究基本還未開展，本文僅綜述了對富勒烯、碳納米管的轉(zhuǎn)化與降解的研究。

2.3.1 碳納米材料的轉(zhuǎn)化

碳納米材料在苛刻的條件下會發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成帶有不同官能團的衍生物，但自然環(huán)境中條件溫和，難以發(fā)生以上轉(zhuǎn)化。此處僅綜述有可能發(fā)生在水環(huán)境中及水生生物體中的氧化還原反應(yīng)。

同許多缺電子烯烴一樣，C60易與自由基發(fā)生反應(yīng)。Kokubo等[43]發(fā)現(xiàn)，在Fe2+存在條件下，可通過H2O2加熱合成水溶性多羥基富勒醇，這種Fenton反應(yīng)被認(rèn)為是水體中真菌水解C60反應(yīng)的一種化學(xué)模式。C60可在氧化劑作用下生成含氧官能團衍生物。P450酶系是自然界中很多生物的重要解毒酶系，Hamano等[44]則模擬P450酶促反應(yīng)體系，對C60進行氧化得到1,2-環(huán)氧C60的產(chǎn)物，因而該反應(yīng)被認(rèn)為是C60在自然界中被生物轉(zhuǎn)化的模式之一。C60氫化反應(yīng)途徑也很多，如硼、鋯氫化反應(yīng)，氫自由基誘導(dǎo)加氫、轉(zhuǎn)移加氫、電化學(xué)還原、固相加氫、二亞胺作用下的化學(xué)還原以及溶解金屬還原、Birch還原和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移等[45-53]，但大部分反應(yīng)條件都比較嚴(yán)苛，目前僅有少量關(guān)于C60在溫和條件下進行氫化反應(yīng)的報導(dǎo)，如C60與脂肪胺中的鋰會發(fā)生氫化反應(yīng)生成C60H36[54]。

CNTs在水環(huán)境中可以發(fā)生化學(xué)氧化反應(yīng)。一般廢水中的氧化劑(如臭氧等)都可以通過產(chǎn)生活性氧來改變CNTs的表面性狀。Datsyuk等[55]發(fā)現(xiàn)， MWCNTs經(jīng)硝酸處理后，CNTs變短并在末端和管壁形成缺陷，并在缺陷處引入大量羥基、羰基、羧基和脂基等含氧官能團。這種高度轉(zhuǎn)變后能為水環(huán)境中微生物及酶促轉(zhuǎn)化提供可進攻位點。Allen等[56]研究發(fā)現(xiàn)SWCNTs在H2O2和血晶素或FeCl3存在條件下也會發(fā)生顯著降解。Osmond-McLeod等[57]也發(fā)現(xiàn)了MWCNTs在模擬生理溶液中培養(yǎng)3周后其外形發(fā)生了顯著變化，CNTs的長度明顯變短，并通過計算分析表明培養(yǎng)過程中損失了30%碳管總質(zhì)量。Russier等[58]模擬細胞吞噬碳納米材料進入體內(nèi)后在吞噬體溶液中的降解轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明強酸氧化產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)缺陷的SWCNTs，其碳管粒徑變小，碳骨骼結(jié)構(gòu)消失，易發(fā)生高度降解。

2.3.2 碳納米材料的生物降解

碳納米材料的生物降解是進入碳循環(huán)的重要途徑，水體中生物種類繁多，在環(huán)境凈化過程中發(fā)揮著重要作用。雖然有關(guān)方面的研究還很少，但碳納米材料與環(huán)境中腐殖酸類、多環(huán)芳烴類、木質(zhì)素類物質(zhì)部分結(jié)構(gòu)相似，而這些已被證實能在水環(huán)境中發(fā)生生物降解[59]，因此碳納米材料很有可能被生物降解。

C60化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，很難發(fā)生生物降解。而C60的衍生物則可以發(fā)生生物降解，如Schreiner等[60]發(fā)現(xiàn)白腐真菌對富勒醇C60(OH)19-27具有生物降解作用，在培養(yǎng)32周后，培養(yǎng)液中褐色的C60(OH)19-27顏色變淺，產(chǎn)物分析結(jié)果顯示：富勒醇籠狀結(jié)構(gòu)被破壞，產(chǎn)生二氧化碳、乙酸等降解產(chǎn)物，同時部分碳被用于合成微生物自身物質(zhì)。

目前，對于CNTs的生物降解性的研究所使用的碳管限于SWCNTs、羧基化單壁碳管(c-SWCNTs)和MWCNTs。同時也僅發(fā)現(xiàn)植物酶中的辣根過氧化物酶(HRP)[55]和動物酶中的人類中性白細胞髓過氧化物酶(MPO)[61]對CNTs具有降解作用。相關(guān)研究表明：HRP對SWCNTs的降解能力取決于CNTs與酶活性部位的接近程度，如Allen等[62]發(fā)現(xiàn)，在H2O2存在條件下，HRP對SWCNTs無降解能力，但在相同條件下HRP對c-SWCNTs卻具有降解能力，是因為強烈的疏水性阻礙了SWCNTs與HRP的活性部位結(jié)合從而不能被有效降解。Zhao等[63]發(fā)現(xiàn)，HRP對MWCNTs的降解與SWCNTs基本相似，其對MWCNTs沒有降解效果，而對O-MWCNTs及氮摻雜的碳管(N-MWCNTs)表現(xiàn)出良好的降解性能。同樣是因為氧化或者氮摻雜過程使CNTs管壁和末端出現(xiàn)缺陷位點，使HRP的親水性位點易于與之結(jié)合，因此引起了酶促降解反應(yīng)的發(fā)生。Russier等[58]發(fā)現(xiàn)，O-MWCNTs在HRP或吞噬溶酶體模擬液的作用下會發(fā)生降解，且HRP對其的降解性能優(yōu)于吞噬溶酶體模擬液。Vlasova等[61]發(fā)現(xiàn)中性白細胞髓過氧化物酶(MPO)能在體外降解c-SWCNT。有研究比較HRP、MPO、LPO(乳過氧化物酶) 和血紅素對c-SWCNT降解能力時發(fā)現(xiàn)，酶促反應(yīng)中產(chǎn)生的次鹵酸鹽在CNTs的降解過程中起著重要作用[64]。Kagan等[65]對MPO降解c-SWCNTs進行了進一步研究。他們發(fā)現(xiàn)除了次鹵酸鹽的強氧化作用，在酶促反應(yīng)中，MPO產(chǎn)生的活性自由基對CNTs的降解也起著重要作用。2012年Shvedova等[66]研究也證明了MPO在CNTs降解方面起著很重要的作用，而且MPO不但在體外試驗中能有效降解CNTs，在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中也能對CNTs起到很好的清除作用。

有研究比較C60的毒性時，發(fā)現(xiàn)nC60只經(jīng)攪拌處理后，在淡水和海水中的最高濃度為35和22.5 mg·kg-1，難以制備到足夠高的濃度而得到LC50，21 d暴露實驗表明2.5和5 mg·kg-1nC60能夠使大型蚤子代數(shù)量減少且蛻皮時間延遲，nC60的暴露不影響細胞色素P450酶的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，卻可以降低黑頭軟口鰷體脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白PMP70的表達水平[67]。

3 碳納米材料對水生生物的毒性效應(yīng)及機理(Toxic effect of carbon nanomaterials on aquatic organisms and its mechanism)

3.1 碳納米材料對水生生物的毒性效應(yīng)

碳納米材料與其他納米材料相比，毒性較小。不同水生生物對碳納米材料產(chǎn)生的毒性所反映的效應(yīng)也不同，因此在研究碳納米材料對水生生物的毒性效應(yīng)時，既要考慮碳納米材料自身的結(jié)構(gòu)特點和與之相對應(yīng)的物理化學(xué)性質(zhì)，也要考慮受試物種自身的各項生理特征。目前大部分的研究主要是通過對模式生物，如單細胞藻類、蚤類、魚類等的實驗室暴露來檢測和論證碳納米材料對水生生物的毒性效應(yīng)。

3.1.1 C60的毒性效應(yīng)

有研究表明，C60的濃度為90 mg·L-1時，對月牙藻生長抑制率大約為30%，C60對斜生柵藻的最低效應(yīng)濃度(LOEC, lowest observable effect concentration)為5.0 mg·L-1。在nC60對大型蚤的暴露實驗中，發(fā)現(xiàn)nC60對大型蚤的生理行為有很大影響，可加快大型蚤的跳躍速率，加快其心跳及附器運動[68]，出現(xiàn)了脫殼延遲、子代數(shù)量減少等現(xiàn)象[69]。也有研究發(fā)現(xiàn)，THF-nC60的溶液濃度只要達到5 mg·L-1就能使實驗的大型蚤達到最大死亡率，而水溶的nC60溶液濃度則要到100 mg·L-1才有明顯死亡率[70]。Tao等[71]利用BLISS分析法確定C60引起新生水蚤的LD50和最低觀測毒性效應(yīng)濃度(LOEC)分別為0.44 mg·L-1和0.2 mg·L-1。同時，C60累計實驗和脂質(zhì)實驗中，發(fā)現(xiàn)在亞致死劑量濃度下，C60可以累積和轉(zhuǎn)移且具有生物活性。Yang等[23]發(fā)現(xiàn)C60(低劑量、21 d)引起大型蚤消化道細胞功能紊亂和細胞溶解或凋亡等慢性損傷。C60濃度高低和粒徑大小會影響其毒性效應(yīng)，如Tao等[70]實驗結(jié)果表明，母代和子代蚤各經(jīng)48 h暴露，其死亡率均隨著C60濃度升高而增加。Oberdorster[72]發(fā)現(xiàn)在生物暴露48 h后，C60可以誘發(fā)大口黑鱸幼魚魚腦內(nèi)部產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。Usenko等[73]對比發(fā)現(xiàn)，納米材料C60、C70對斑馬魚胚胎具有相近毒理性質(zhì)，當(dāng)納米材料C60、C70的濃度達到200 μg·L-1時，會使部分斑馬魚胚胎發(fā)育畸形，且存活率明顯下降；朱小山等[74]的研究表明，長期低劑量C60(0.0～1.0 mg·L-1)暴露30 d能導(dǎo)致鯽魚的腦、肝、鰓等器官組織中還原型谷胱甘肽含量顯著降低，并能顯著激活肝組織中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性，以及鰓中Na+/K+-ATP酶的活性。納米C60顆粒懸浮液的制備方法不同，其對生物的生態(tài)毒性也不一樣，其中經(jīng)過甲苯作為表面活性劑處理的納米C60顆粒懸浮液對斑馬魚胚胎的毒性最強。

3.1.2 CNTs的毒性效應(yīng)

對于CNTs對水生生物的影響，朱小山等[75]研究表明，SWCNTs、MWCNTs對斜生柵藻的毒性效應(yīng)并不存在顯著性差異。Wei等[76]研究發(fā)現(xiàn)羧基化的MWCNTs能夠抑制杜氏藻的生長，并且會影響其PSII光化學(xué)反應(yīng)過程以及細胞內(nèi)谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)對暴露于功能化MWCNTs溶液中的杜氏藻的研究表明MWCNTs與藻細胞或細胞代謝產(chǎn)物之間存在相互作用，促進了CNTs的聚集，從而產(chǎn)生了毒性作用[77]。Roberts等[78]研究發(fā)現(xiàn)溶血性磷脂酰包覆的水溶性單壁碳納米管(LPC-SWCNTs)可被大型蚤通過攝食行為攝入體內(nèi)，低濃度的LPC-SWCNTs不會引起大型蚤死亡，而10和20 mg·L-1的LPC-SWCNTs可分別導(dǎo)致20%和100%的大型蚤死亡率。研究SWCNTs和MWCNTs的發(fā)育毒性實驗通常利用斑馬魚的胚胎來完成，相關(guān)實驗顯示：當(dāng)SWCNTs的暴露濃度達到或超過240 mg·kg-1時會使孵化延遲[79]，劉信勇等[80-81]發(fā)現(xiàn)，MWCNTs進入斑馬魚體內(nèi)后，會對斑馬魚腦組織產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致其乙酰膽堿酯酶活性降低。而且斑馬魚在MWCNTs中暴露具有時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，當(dāng)暴露的時間越長，暴露濃度越大，受到的影響越明顯。尤宏等[82]的研究顯示CNTs對胚胎孵化率沒有顯著抑制，但是能夠延長斑馬魚胚胎孵化時間，而且與暴露濃度存在濃度劑量效應(yīng)關(guān)系，唐志楊等[83]發(fā)現(xiàn)當(dāng)SWCNTs濃度低于10 mg·L-1時，其對斑馬魚各組織中GSH含量及SOD活性無明顯影響，但能導(dǎo)致斑馬魚的肝、鰓、腦組織中Na+-K+-ATP酶活性顯著增加，MDA含量明顯下降。

3.1.3 石墨烯的毒性效應(yīng)

對于石墨烯，GO對藻類細胞進行暴露后能夠抑制藻細胞的生長，并能導(dǎo)致活性氧的生成，及干擾抗氧化酶的產(chǎn)生和藻細胞的代謝等[84]。Guo等[85]將水生生物大型蚤經(jīng)水體暴露于石墨烯，發(fā)現(xiàn)石墨烯主要在大型蚤腸道內(nèi)累積，并能轉(zhuǎn)移到子代，但沒有發(fā)現(xiàn)毒性效應(yīng)。Chen等[86]研究發(fā)現(xiàn)，GO通過羥基相互作用附著在斑馬魚胚胎絨毛膜上，使胚胎細胞缺氧并阻礙細胞膜的通透性，從而導(dǎo)致孵化延遲。進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過內(nèi)吞作用進入胚胎細胞的石墨稀，會導(dǎo)致線粒體受損；GO還會通過心臟、眼睛等器官進入斑馬魚的循環(huán)系統(tǒng)，使活性氧含量增加，氧化應(yīng)激性增強，進一步造成DNA損傷和細胞調(diào)亡。

3.1.4 與其他物質(zhì)共存時的毒性效應(yīng)

納米材料在制備過程中，或者因為高比表面積容易攜帶有毒物質(zhì)，不僅影響污染物的環(huán)境存在狀態(tài)和遷移轉(zhuǎn)化，也會作為污染物的載體，增大污染物的生物利用性和毒性效應(yīng)等，從而導(dǎo)致生物體中毒，引起嚴(yán)重的生態(tài)后果，具有潛在的生態(tài)風(fēng)險[87]。Wang等[88]發(fā)現(xiàn)不經(jīng)過酸化處理的MWCNT由于其表面缺少功能集團對重金屬基本不吸收，但是增大了對疏水性有機污染物(PAH)的吸附量[89]。nC60對甲基對硫磷、阿特拉津、五氯苯酚和菲(Phe)的吸附試驗結(jié)果顯示，nC60聚集體和玻璃瓶壁上同時具有這4種物質(zhì)，其中Phe主要集中在nC60聚集體上，而其他的3種物質(zhì)多分布在溶液中，這可能與菲較大的疏水性有關(guān)致使nC60對Phe的吸附容量最大[90]。劉信勇等[80]發(fā)現(xiàn)，不足以引起斑馬魚毒性濃度的MWCNTs會明顯增強Pb、Zn的致死效應(yīng)，這可能與MWCNTs具備較強的吸附能力有關(guān)。Kim等[91]發(fā)現(xiàn)lysophosphatidylcholine(LPC)修飾的MWCNTs增強了大型蚤對Cu2+的吸收以及毒性。Baun等[90]在nC60存在條件下，Phe對月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)的EC50由720 μg·L-1降低至430 μg·L-1，這可能由于nC60-Phe聚集體吸附在細胞膜表面，進而對生物體產(chǎn)生毒性。

有研究發(fā)現(xiàn)，黑頭軟口鰷在1 mg·L-1的THF/nC60溶液中100%死亡，而同濃度的aqu/nC60卻沒有影響，上述細胞毒性主要來自THF的光解副產(chǎn)物γ-丁丙酯和蟻酸[91-93]。CNTs的毒性可能主要來自自身所含的雜質(zhì)，包括金屬催化劑、不定形碳等，如Shvedova實驗室的研究[94]顯示，未純化的金屬殘留量高的CNTs引起的氧化應(yīng)激水平明顯高于純化的金屬殘留少的CNTs[95]，其他研究也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果[95-96]，如果CNTs表面吸附了多環(huán)芳烴等有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)都可能導(dǎo)致生物中毒[97-98]。

當(dāng)前對納米材料的毒性研究仍然存在爭議，如對CNTs毒性的一些研究結(jié)果表明其沒有明顯的毒性[99]，而有一些研究卻出現(xiàn)相反的情況[100]。對石墨烯的研究也出現(xiàn)類似的矛盾報道[101-102]。Kagan等[102]研究表明：SWCNTs的微晶結(jié)構(gòu)可以通過酶促反應(yīng)得到降解，次氯酸鹽和人類嗜中性粒細胞髓過氧化物酶的幾個活性自由基中間體，在嗜中性粒細胞和巨噬細胞中均可降解SWCNTs。被降解的碳納米管是惰性的，并且進入小鼠肺細胞后并沒有引起任何炎癥反應(yīng)。因此，當(dāng)這種SWCNTs將藥物輸送到目的組織或細胞后，會很快地發(fā)生生物降解，降低了生物體的實際暴露劑量和時間。利用萘終止PEG修飾的GO對斑馬魚魚卵進行毒理實驗，結(jié)果表明：斑馬魚可以在GO對它們的發(fā)育尚未產(chǎn)生明顯負面影響之前將其排出體外，可見GO經(jīng)過修飾后可以降低其生物體內(nèi)的暴露停留時間[104]。這是因為納米材料的毒性由很多因素共同影響，如納米材料的純度、尺寸、表面電荷、表面修飾、親疏水性、暴露時間、暴露劑量和反應(yīng)介質(zhì)等[105]。

3.2 碳納米材料可能的毒性機理

目前普遍認(rèn)為的碳納米材料毒性機制主要包括氧化脅迫、引起炎癥反應(yīng)、干擾生物信號的傳遞、破壞細胞完整性、基因毒性等[106-107]。

3.2.1 氧化應(yīng)激毒性機理

該機制是目前被廣泛認(rèn)可的納米材料產(chǎn)生毒性效應(yīng)的主要機理之一[108]。生物體內(nèi)有氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的存在，保持了生物體內(nèi)活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生和消除的平衡。生物體通過體內(nèi)的抗氧化酶，如谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶來消除多余的ROS，而ROS的產(chǎn)生一旦超出生物的清除能力，則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。由于碳納米材料具有較強的表面活性，因此它們可以解除生物體內(nèi)電子供體或者再吸收能量時產(chǎn)生ROS。ROS主要包括H2O2及HO2、·OH，其大量累積且不能被及時去除就會對生物體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成生物毒性效應(yīng)。在正常的條件下，線粒體內(nèi)的ROS含量較低，且很容易被一些抗氧化劑中和。碳納米材料可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，破壞線粒體的抗氧化防御體系，ROS平衡也被打破，大量的氧化型谷胱甘肽積累導(dǎo)致細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激增大，進而喪失細胞功能，直到細胞死亡，使正常的生理機能受到影響。其他的毒性機制，如蛋白質(zhì)變性、DNA損傷等也可能由ROS造成的氧化損傷引起。

3.2.2 納米材料引起炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是免疫系統(tǒng)識別并清除入侵外來物質(zhì)的過程，包括免疫細胞的活化和向病變部位的聚集。納米材料經(jīng)內(nèi)吞作用進入免疫細胞，可以通過刺激免疫細胞產(chǎn)生趨化因子(IL-8，MCP-1) 和促炎癥因子(IL-1，TNF-α，IFN-γ)，誘導(dǎo)并加速炎癥反應(yīng)。納米顆粒對炎癥反應(yīng)的影響還涉及到對Th1/Th2 免疫反應(yīng)類型的調(diào)節(jié)。Th細胞引發(fā)的炎癥信號可以進一步活化B、T淋巴細胞和巨噬細胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)。一些研究[109]認(rèn)為，通常較小的顆粒(<500 nm)引起Th2 型免疫反應(yīng)，而較大的顆粒(>1 μm)引起 Th1 型免疫反應(yīng)[110]。

3.2.3 干擾生物信號的傳遞

碳納米顆粒也可與生物體的蛋白質(zhì)相互作用，干擾基因信息以及生物信號的傳遞[111-112]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)α-胰凝乳蛋白酶吸附在SWCNTs上后，α-胰凝乳蛋白酶二級結(jié)構(gòu)中的肽鏈會展開吸附在CNTs表面，致使α-胰凝乳蛋白酶的失活[113]。另有研究發(fā)現(xiàn)，牛血清白蛋白(BSA) 和蛋白溶解酵素(LYS)吸附結(jié)合在CNTs表面后，蛋白質(zhì)的疏水基團會暴露于溶液中，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。

3.2.4 破壞細胞完整性

碳納米材料可以通過細胞的內(nèi)吞作用、膜滲透作用、或通過載體蛋白和離子通道等運輸?shù)郊毎麅?nèi)部[114]，然后產(chǎn)生毒性[115-116]。例如，有研究認(rèn)為，CNTs對細菌的毒性是通過直接損傷細胞膜并導(dǎo)致其代謝能力下降和核酸外泄引起的[117]。大型蚤在低劑量的C60水溶液中暴露21 d后，消化道細胞結(jié)構(gòu)明顯被破壞[118]。另外有研究指出，由于石墨烯的物理特性，即石墨烯片層邊緣鋒利，在與藻細胞接觸的過程中，會像刀鋒一樣切割藻細胞細胞壁，使其細胞壁破裂[119]。這與Hu等[120]發(fā)現(xiàn)的石墨烯會對細菌細胞膜造成機械損傷的結(jié)論相符。在GO處理下，有研究觀察到小球藻藻細胞質(zhì)壁分離的現(xiàn)象[84]。

3.2.5 基因毒性

一些納米材料能使DNA雙鏈斷裂，破壞DNA的完整性，從而產(chǎn)生毒理效應(yīng)[121]。分子動態(tài)模擬研究表明，液體中C60極易與DNA中的核苷穩(wěn)定結(jié)合并使DNA變形而可能喪失功能[122]。

3.2.6 混合毒性

細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)可使細胞內(nèi)的氧化還原平衡遭到破壞，其結(jié)果是使一些組蛋白發(fā)生乙?；饔?，導(dǎo)致這些組蛋白與DNA的結(jié)合松開，提供轉(zhuǎn)錄混合物到達致炎基因啟動子區(qū)的途徑。氧化應(yīng)激引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-kB 轉(zhuǎn)移到細胞核中，并到達關(guān)鍵致炎基因的啟動子區(qū)，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。受NF-kB 調(diào)控的致炎基因包括TNFɑ，IL-8，IL-2，IL-6，GM-CSF，ICAM-1和E-選擇iNOS等，因此 NF-kB 的活化可被認(rèn)為存在高致炎作用。而且，氧化應(yīng)激或者直接的與顆粒的相互作用都能刺激細胞溶質(zhì) Ca2+濃度的上升，這也會引起NF-kB 的活化。鈣離子信號也可能控制能導(dǎo)致正反饋機制的活性氧的產(chǎn)生。上述過程的聯(lián)合作用，將使基因的轉(zhuǎn)錄達到頂點，導(dǎo)致發(fā)炎和抗氧化劑生產(chǎn)的上升。

現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示不同的納米顆粒在生態(tài)毒理和毒性上不盡相同，即使同一類納米材料，由于使用對象不同，其致毒機制也可能大有不同，同時致毒機理可能并不是只由某一種機理控制，有可能其通過多種機制最后產(chǎn)生綜合毒性效應(yīng)。碳納米材料的毒性究竟具體源自哪些方面仍有待于進一步研究。

4 研究展望(Research prospects)

綜上所述，科學(xué)探索已對碳納米材料對水環(huán)境的潛在生物毒性做了一些工作，對其致毒機制也有了一些認(rèn)識，這些工作對碳納米材料生產(chǎn)和使用等的評價和管理具有較大的參考價值。盡管人們已經(jīng)開始研究碳納米材料的自身毒性以及其對環(huán)境的潛在危害，但相關(guān)研究工作仍處于探索階段，人們對它自身的毒性強度及持續(xù)時間等仍不清楚，同時碳納米材料可能產(chǎn)生很多潛在的環(huán)境和健康風(fēng)險，這些方面也仍然沒有得到全面的了解，對于碳納米材料是否真的有毒以及其致毒機制也沒有完全達成共識。目前尚存在以下幾個主要問題，需進一步深入研究，以準(zhǔn)確闡述碳納米材料可能導(dǎo)致的環(huán)境和健康風(fēng)險。

(1)對碳納米材料的毒性研究需建立系統(tǒng)而完善的標(biāo)準(zhǔn)；

(2)碳納米材料在不同水質(zhì)和水文條件下的物理化學(xué)狀態(tài)及其毒性；

(3)應(yīng)關(guān)注碳納米材料對生物長期低劑量暴露所導(dǎo)致的生物毒性效應(yīng)；

(4)碳納米材料與其他環(huán)境因素或異質(zhì)的聯(lián)合毒性效應(yīng)；

(5)要準(zhǔn)確闡述納米材料可能的環(huán)境和健康風(fēng)險，還需要考慮在環(huán)境條件下真實的狀態(tài)對生物毒性的效應(yīng)。

在未來的生產(chǎn)生活中，碳納米材料的使用及排放都將大量增加。在其被廣泛使用前，我們必須通過嚴(yán)格的科學(xué)研究搞清它們對環(huán)境以及人類健康可能造成的負面影響特別是它們所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。碳納米材料的結(jié)構(gòu)多樣性及環(huán)境因素的復(fù)雜性是研究碳納米材料毒理學(xué)效應(yīng)的一個重大挑戰(zhàn)。

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