板栗殼生藥研究及有效成分沒食子酸、綠原酸、蘆丁含量的測定

范雙雙，曾濤，朱毓永

（河北民族師范學(xué)院，河北 承德 067000）

我國是板栗產(chǎn)量最大的國家，每年板栗的消耗量也最大，但是量大的板栗殼處理工作，成為人們關(guān)注的一個(gè)重要課題。研究發(fā)現(xiàn)，板栗殼中含有大量的藥學(xué)價(jià)值的成分，藥性甘甜，對心血管疾病有著很好的防治功效，還能調(diào)理脾胃等疾病。其中通過對板栗殼進(jìn)行乙醇提取之后，發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的沒食子酸、綠原酸、蘆丁、綠膿桿菌等。沒食子酸對腸道中的菌群具有一定的刺激作用，能殺滅腸道細(xì)菌，治療胃腸道疾病。因此，提取板栗殼的成分具有重要意義。下面將對有效成分的測定及其結(jié)果進(jìn)行研究，總結(jié)報(bào)告如下。

1 一般資料與方法

1.1 材料與設(shè)備

板栗去殼，將板栗殼研磨成粉末，置于陰涼處備用；選取90%的沒食子酸作為對照品，96．6%的綠原酸對照品及90．7%的蘆丁對照品。甲醇、乙睛、色譜純、超純水等。高效液相色譜儀，型號1510系列，高壓四元泵，在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、PDA二極管陣列檢測器、柱溫箱、顯微鏡系統(tǒng)即攝像頭；超聲波清洗器、電子天平秤及粉碎機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

（1）樣品配制。將板栗殼置于顯微鏡下，使用粉碎機(jī)將板栗殼碾壓成粉末，進(jìn)行切片配制；選取丙三醇-50%乙醇（1:1）溶液中軟化48h，依次轉(zhuǎn)移到70%乙醇、80%乙醇及90%的乙醇，使用脫洗機(jī)進(jìn)行脫洗，分別于3h后，使用無水乙醇溶液進(jìn)行2次沖洗，10min/次。脫水后將材料依次放于正丁醇-無水乙醇，1h后置于正丁醇-無水乙醇溶液中再進(jìn)行脫洗，30min后，置于正丁醇中反復(fù)再沖洗1次。待溶液徹底清澈后，將石蠟加入融合，調(diào)制成1:1比例的溶液，將混合溶液倒出；將55℃的石蠟置于器皿中，然后將溶液置于其中24～48h；浸潤完畢后，將材料埋于石蠟中，完全凝固后制成切片，10～16μm1片，使用蒸餾水將切片沖洗干凈，置于恒溫臺上的展片中，使用電熱干燥劑進(jìn)行烘干，完全去水后，置于烘干機(jī)中，設(shè)定溫度為36℃，烘切片24h，并進(jìn)行2次熔蠟，30min/次，依次放入二甲苯-無乙醇水溶液中，再此進(jìn)行染色，操作同前面切片的制作流程，最終獲得固體切片，然后使用顯微鏡進(jìn)行觀察，并拍照。粉末切片目篩，選擇粉碎過后的40目篩，取粉末少量作為樣品，置于干凈的載玻片上，滴加水合氯醛溶液，使用酒精燈加熱，滴上稀甘油溶液，密封后置于顯微鏡下觀察，觀察中橫切面細(xì)胞分布狀態(tài)。

（2）色譜測定方法。使用Hypersil ODS2型號的高效液相色譜儀器，設(shè)定色譜柱為250×46mm，5μm；使用乙睛-水-甲醇-水溶液，與水混合配制成水醋酸或磷酸作為流動相，利用等度進(jìn)行脫洗，分離沒食子酸、綠原酸及蘆丁成分，設(shè)定最大可獲取波長為275nm，流速為1ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積為10μL。分別取沒食子酸1．4mg/ml、綠原酸 1．73mg/ml及蘆丁 1．4mg/ml對照品，加乙醇溶液進(jìn)行固定，測定獲得沒食子酸、氯酸溶液及蘆丁的 含 量 分 別 為 52．34、66．01 和 49．80μg/ml； 將 所有溶液都配制并裝于器皿中，置于4℃溫度中備用。

（3）供試品溶液的配制。對板栗殼進(jìn)行目篩后，恒溫干燥。使用天平秤稱取0．2g板栗殼粉末，分別加入極性不同的甲醇、乙醇、乙酸乙酯各30ml，置于40℃，頻率為20kHz超聲設(shè)備下，間歇提取45min，冷卻過濾后，蒸發(fā)后提取溶劑，殘?jiān)刑砑蛹状既芙舛ㄈ葜?5ml，用0．23μm有機(jī)過濾。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下在縱橫切面成像的特征

按照板栗殼的橫切面、縱切面果皮細(xì)胞的特點(diǎn)，中果皮石細(xì)胞和石細(xì)胞環(huán)帶、內(nèi)果為較多的非腺毛果皮。其中有很多的石細(xì)胞，細(xì)胞呈不均勻結(jié)構(gòu)、大小，排列并不規(guī)律；壁稍厚，且外面有一層角質(zhì)層；中果皮由數(shù)列細(xì)胞組成，且零散有小型外韌纖維管束，內(nèi)果皮上有薄壁細(xì)胞。

2.2 切片基底組織的特征

根據(jù)縱橫切面的分布特點(diǎn)，切片基底組織也呈現(xiàn)一定的特點(diǎn)，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)有方晶體和草酸鈣晶體，大量的石細(xì)胞呈圓形，且還有石細(xì)胞群帶，呈不規(guī)則分布，分枝狀，可見明顯的分枝，并且有明顯的空隙。

2.3 沒食子酸、綠原酸及蘆丁含量的測定

樣品處理?xiàng)l件下，選取不同比例的乙醇和甲醇，板栗殼提取溶液呈深色，含有量的沉淀素，有可能使得測定結(jié)果受到一定的干擾。在經(jīng)過萃取后，使用石油醚浸潤后，通過乙酸乙酯超聲脫洗，最終提升了測定結(jié)果的精準(zhǔn)度。經(jīng)過上述樣品的配制后，精密度取板栗粉末0．2g；在30ml石油醚浸潤30min后，棄去石油醚液，過濾藥渣并蒸干；加30ml乙酸乙酯，經(jīng)過間歇性超聲提取后再次過濾，去掉乙酸乙酯后，殘?jiān)蛹状既芤海⒔舛ㄈ芤褐?5ml。最終在色譜條件下，獲得了乙腈-0．4%磷酸或甲醇-0．4%磷酸，通過梯度脫洗之后，形成3種成分，并分離其它液體的干擾，最終在色譜測定下，獲得沒食子酸含量 0．33～0．3649mg/g、綠原酸為0．128～0．142mg/g、蘆丁為 0．183～0．234mg/g。色譜對 3種成分的敏感度均較高，且呈一定規(guī)律的波長。

3 結(jié)果

板栗作為重要的殼斗科植物，具有很強(qiáng)的生藥價(jià)值，在現(xiàn)代藥理研究中，均表明其具有很高的醫(yī)用價(jià)值，作用十分廣泛。因此，加強(qiáng)對板栗殼中有效成分的提取，不僅能減輕我國每年處理板栗殼產(chǎn)量的壓力，還能有效合理地開發(fā)和利用板栗殼的優(yōu)先生藥資源，為臨床提取藥物品種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，我國應(yīng)該注重全面提升板栗殼的醫(yī)藥和保健價(jià)值。板栗殼中含有大量的乙醇、乙酸乙酯、氯仿及丁正醇，還有豐富的黃酮、酚類及有機(jī)酸等類物質(zhì)，以沒食子酸、綠原酸及蘆丁等成分為主，是重要的抗菌消炎的成分，還能預(yù)防衰老，抗氧化和自由基，預(yù)防腫瘤等藥理活性。所以，對其成分及含量的測定，能建立板栗殼的質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)韋琴的研究結(jié)果，他采用高效液相色譜和鐵鹽催化比色法，對板栗殼中的原花青素成分進(jìn)行測定，最終發(fā)現(xiàn)高效液相色譜技術(shù)的應(yīng)用，其操作方便，效果精準(zhǔn)，實(shí)踐證實(shí)了該方法的應(yīng)用價(jià)值。在本次研究中，也使用了高效液相色譜對其含量進(jìn)行測定，其結(jié)果顯示，板栗殼在顯微鑒定下，呈一定的特征，中橫切面外果皮細(xì)胞呈圓柱形或柵狀排列，其中含有較大的石細(xì)胞或石細(xì)胞群，中果皮內(nèi)側(cè)有石細(xì)胞呈環(huán)狀帶，并密集分布著草酸鈣簇晶體和方晶體。最終通過作性狀、組織切片及粉末特征的處理后發(fā)現(xiàn)，采用高效液相色譜對沒食子酸、綠原酸及蘆丁含量進(jìn)行測定后，發(fā)現(xiàn)3種成分的含量分別呈一定的相關(guān)性，且RSD峰面曲線也存在一定的特點(diǎn)。高效液相色譜測定方法，在操作中更加方便，且結(jié)果精準(zhǔn)，為板栗殼生藥標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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