細胞塊在非小細胞肺癌診斷及基因檢測中的運用

陳青 王筱俊 郭廣秀 張功亮

1 贛州市人民醫(yī)院 病理科 （江西 贛州 341000）

2 贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 （江西 贛州 341000）

內(nèi)容提要： 目的：探討細胞塊在非小細胞肺癌診斷及基因檢測中的意義。方法：收集贛州市人民醫(yī)院從2015年1月～2018年5月的40例細胞塊診斷為非小細胞肺癌病例（細胞學(xué)涂片+細胞塊HE及免疫組化），其中20例經(jīng)過纖支鏡活檢證實。用二代測序法檢測EGFR（18、19、20及21號外顯子）。結(jié)果：其中20例行纖支鏡活檢的診斷結(jié)果與細胞塊及免疫組化診斷結(jié)果一致。EGFR總突變?yōu)?0%（12/40），其中21號占58.33%（7/12），19號為41.67%（5/12），兩者同時突變8.33%（1/12）。結(jié)論：細胞塊結(jié)合免疫表型可用于標(biāo)準(zhǔn)診斷肺癌及其分類。細胞塊可用二代測序法檢測EGFR。

肺癌是最常見的惡性腫瘤，并且我國肺癌發(fā)病率逐年上升。雖然手術(shù)和化療技術(shù)不斷提高，但是患者的愈后仍然很差。近年來，多種靶向藥物在臨床的運用，治療效果有了明顯的提高。針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變陽性的肺癌患者，NCCN指南建議的一線治療方案包括EGFR-TKIs[1]。在肺癌患者，特別是晚期肺癌或周圍型肺癌患者、無法對原發(fā)病灶進行活檢的患者，利用肺泡灌洗液、纖支鏡涂片、CT引導(dǎo)下腫物穿刺或胸腔積液作成細胞塊，結(jié)合細胞形態(tài)及免疫表型，可以進行準(zhǔn)確的診斷及腫瘤病理分類。為了制定準(zhǔn)確的個體化、可靠的靶向治療方案，細胞塊還可以進行分子檢測。

1.材料與方法

1.1 材料

選擇2015年1月～2018年5月在贛州市人民醫(yī)院收集的60例細胞塊診斷為非小細胞肺癌病例，包括：細胞涂片、細胞塊HE及免疫組化。棄去腫瘤細胞少的20例，剩余腫瘤細胞較多的40例，腫瘤細胞占細胞比大于30%并且腫瘤細胞量大于500個。其中胸水20例，纖支鏡涂片10例，肺泡灌洗液10例。其中纖支鏡涂片及肺泡灌洗液的10例均經(jīng)活檢與組織對照。其中男性25例，女性15例。年齡為35～76歲。

1.2 主要儀器

萊卡ASP300S脫水機；麥新全自動免疫組化儀PathcomSS1；萊卡RM2235切片機；蔡司AX10顯微鏡。

1.3 試劑

從福州邁新生物技術(shù)有限公司購買免疫組化試劑，按實驗步驟及試劑說明書操作全自動免疫組化儀。

1.4 方法

（1）收集患者胸水或肺泡灌洗液，放置大約1h。如果胸水或肺泡灌洗液量較多，舍去部分上清液，保留50～200mL沉淀液。將該沉淀液進行離心操作（離心參數(shù)：2000r/min，10min）；（2）離心后，舍棄上清液，保留沉淀物。用該沉淀物做細胞學(xué)涂片。對臨床送檢的部分纖支鏡涂片進行瑞氏染色。從剩余的纖支鏡涂片中刮取細胞制作細胞塊。在CT引導(dǎo)下的腫物穿刺吸取的腫瘤組織直接涂片，風(fēng)干后，進行瑞氏染色。用紗布包裹剩余組織，跟小標(biāo)本活檢組織一起脫水；（3）進行瑞氏染色細胞涂片。再由2名高年資細胞病理主治醫(yī)師進行閱片，給出細胞學(xué)診斷報告；（4）加20mL的10%中性福爾馬林固定液到剩余沉淀物內(nèi)，10～20min后，進行離心沉淀（離心參數(shù)：5000r/min，15min）；（5）離心后，放置2～3h，舍去固定液。用紗布將沉淀物包裹后，跟活檢小標(biāo)本一起脫水，然后制作成細胞塊；（6）使用常規(guī)石蠟包埋技術(shù)進行切片，切片厚度為5～8μm。使用蘇木精-伊紅染色，再使用中性樹膠進行封固；（7）由2名高年資細胞病理主治醫(yī)師進行細胞塊HE閱片，選用抗體：TTF-1、CK7、NAPsin-A、P63、P40、CK5/6、EGFR、MC、KI-67、CD68、CA-125、CK20、CEA及CDX-2等；（8）結(jié)合細胞學(xué)、HE形態(tài)及免疫表現(xiàn)進行分析及診斷；（9）EGFR基因檢測由金域檢驗中心代做，采用二代測序法檢測EGFR（18、19、20及21號外顯子）。

2.結(jié)果

40例肺腺癌病例中，其中男性25例，女性15例，其中支氣管涂片及肺泡灌洗液各10例，這20例行纖支鏡活檢，組織學(xué)診斷結(jié)果與細胞塊及免疫組化診斷一致。EGFR總突變?yōu)?0%（12/40），女性突變率40%（6/15），男性突變率24%（6/25），其中 21號占58.33%（7/12），19號為41.67%（5/12），兩者同時突變8.33%（1/12）。

3.討論

目前，病理組織學(xué)檢查與診斷是肺癌診斷及EGFR檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是肺癌被確診時常常已經(jīng)為Ⅲ、Ⅳ期，無法進行手術(shù)治療，難于獲得整塊的腫瘤組織。CT或B超引導(dǎo)下腫物穿刺、胸水細胞塊制作及電子支氣管鏡涂片是晚期肺癌診斷及進行基因檢測標(biāo)本來源的主要手段。國內(nèi)外均有在非小細胞肺癌中用細胞塊做免疫組化及EGFR基因檢測的相關(guān)報道[2,3]。本研究結(jié)果顯示，細胞塊可用于診斷肺癌及其分類；細胞塊可用二代測序法進行EGFR基因檢測。

EGFR又叫HER-1，為HER家族的成員之一，是一種跨膜糖蛋白，分布于細胞膜的表面，調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育及抑制細胞的凋亡。大量的研究顯示，EGFR在肺腺癌中的表達明顯高于鱗狀細胞癌及小細胞癌，本研究中EGFR突變?yōu)?0%，與文獻報道相符[4-7]。EGFR突變部位主要位于外顯子18、19、20及21，其中外顯子19和外顯子21突變率占90%以上，本研究也顯示相同的結(jié)果。外顯子19和21的主要突變特征為：外顯子19的堿基缺失，從而氨基酸編碼序列丟失。外顯子21為點突變，位于DGF附近，增強了A-loop的穩(wěn)定性，第858位密碼子的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，也增強了腫瘤細胞對EGFR-TKIs的敏感性。

文獻報道，EGFR突變的高發(fā)人群為亞洲女性，不吸煙的肺腺癌患者。本研究也顯示女性肺腺癌EGRF突變率大于男性，女性突變率40%，男性突變率24%。另有研究顯示原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中EGFR的突變存在異質(zhì)性，本研究只檢測了原發(fā)灶，未進行轉(zhuǎn)移灶的檢測，是否存在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的突變不一致性，需待進一步研究。