應(yīng)用蠶豆微核技術(shù)監(jiān)測(cè)渭河寶雞段水質(zhì)污染狀況

李愛(ài)玲+賈盼

摘要：采用蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)，對(duì)渭河寶雞段的上、中、下游水樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，渭河寶雞段上、中、下游水樣的微核率平均分別為1.23‰、1.65‰和1.74‰；污染指數(shù)分別為1.84（輕度污染）、2.46（中度污染）和2.60（中度污染）。隨著水污染程度的加重，過(guò)氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）呈升高趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：蠶豆；渭河；微核率；污染指數(shù)

中圖分類號(hào)：X522；X132 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4727-04

寶雞市依托渭河而立，是中原通往西南、西北的交通樞紐，陜、甘、川、寧四省（區(qū)）毗鄰地區(qū)的商貿(mào)和物流中心，是西部大開發(fā)承東啟西的重要支點(diǎn)。

目前，對(duì)水體監(jiān)測(cè)有多種方法，而微核試驗(yàn)是根據(jù)被打斷的DNA分子或由紡錘絲斷裂造成整條染色體落后于核分裂形成微核的現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)某些理化因素造成遺傳損傷的一種簡(jiǎn)便、快速的遺傳毒理學(xué)研究方法。微核試驗(yàn)具有敏感度高、快速經(jīng)濟(jì)、不需要精尖技術(shù)等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)中應(yīng)用較為廣泛[1-3]。蠶豆根尖微核試驗(yàn)是世界范圍內(nèi)推廣運(yùn)用的環(huán)境致突變性檢測(cè)技術(shù)，20世紀(jì)80年代初，世界衛(wèi)生組織（WHO）、聯(lián)合國(guó)環(huán)境署（UNEP）和美國(guó)國(guó)家環(huán)保局（USEPA）相繼確定了蠶豆根尖微核試驗(yàn)在環(huán)境化學(xué)物致突變性檢測(cè)中的作用，并建議在全世界范圍內(nèi)推廣[4-6]，1986年，被中國(guó)環(huán)保局列為水環(huán)境生物測(cè)試的規(guī)范方法，用于檢測(cè)水體的致突變性[7]。

隨著城市人口的增加、工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，渭河水質(zhì)污染問(wèn)題已引起社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。對(duì)渭河水質(zhì)污染狀況的研究，通常利用常規(guī)物理化學(xué)手段進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而有關(guān)生物學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)污染情況的研究鮮有報(bào)道。本研究采取渭河寶雞段上、中、下游水樣分別對(duì)蠶豆進(jìn)行處理，通過(guò)測(cè)定蠶豆根尖細(xì)胞的微核率、污染程度和過(guò)氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的變化，并結(jié)合各采樣點(diǎn)河段污水排放情況，綜合評(píng)價(jià)了渭河寶雞段的水質(zhì)污染狀況，為有效開展水體污染監(jiān)測(cè)、農(nóng)田灌溉等水污染引起健康危害的預(yù)防提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 西安市售優(yōu)質(zhì)青皮蠶豆；環(huán)磷酰胺，上海第十二制藥廠；H2O2測(cè)定試劑盒（比色法）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒（羥胺法）、MDA測(cè)定試劑盒（TBA法）和SOD測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；改良苯酚品紅染色液，北京雷根生物技術(shù)有限公司。其他常用試劑為分析純或生化試劑。

1.1.2 儀器 數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)（Leica DM750），徠卡公司和聯(lián)想（北京）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；臺(tái)式離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；721型分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水樣采集 渭河寶雞段主要接納工業(yè)廢水和居民生活廢水，周圍有居民聚集區(qū)、工業(yè)廠房等建筑，附近還有山脈、森林等自然環(huán)境。2015年9月，依據(jù)渭河水質(zhì)狀況及兩岸污染源，分別取渭河寶雞段上、中、下游水樣，每樣點(diǎn)采集水樣1 000 mL，于4 ℃冰箱避光保存，用于蠶豆根尖細(xì)胞微核檢測(cè)。同時(shí)觀察記錄水質(zhì)表觀特征及兩岸污染源情況。

1.2.2 微核試驗(yàn) 選取無(wú)蟲害、無(wú)霉變的飽滿蠶豆，試驗(yàn)操作步驟和方法見參考文獻(xiàn)[8，9]，分別用渭河寶雞段上、中、下游水樣培養(yǎng)蠶豆根尖作為試驗(yàn)組；陰性對(duì)照為自來(lái)水培養(yǎng)的蠶豆根尖；陽(yáng)性對(duì)照為 2 mg/L環(huán)磷酰胺培養(yǎng)的蠶豆根尖。

1.2.3 微核率統(tǒng)計(jì) 玻片的編號(hào)與計(jì)數(shù)采用盲法。計(jì)數(shù)時(shí)，選取涂片及染色質(zhì)量好的區(qū)域，避開過(guò)分重疊和細(xì)胞破壞的區(qū)域。微核直徑小于主核的1/3，結(jié)構(gòu)和顏色深淺同主核相似，轉(zhuǎn)動(dòng)顯微鏡微調(diào)時(shí)，與主核處于同一水平面。每個(gè)試驗(yàn)組鏡檢5個(gè)以上的根尖，每個(gè)根尖至少觀察1 000個(gè)分散良好、質(zhì)核清晰的間期細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)微核細(xì)胞數(shù)。每個(gè)試驗(yàn)組統(tǒng)計(jì)3次，取平均值，計(jì)算微核率，微核率（MCN）=微核個(gè)數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1 000‰[10]。

根據(jù)國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局用蠶豆根尖微核試驗(yàn)對(duì)水質(zhì)污染評(píng)價(jià)的“污染指數(shù)”概念，水體受污染程度采用污染指數(shù)（PI=待測(cè)水樣微核率/陰性對(duì)照組微核率）來(lái)劃分[7]。

1.2.4 過(guò)氧化氫、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的測(cè)定 以蠶豆胚根為材料，H2O2、MDA和SOD測(cè)定采用南京建成生物工程研究所相應(yīng)的試劑盒，按照說(shuō)明書所述步驟進(jìn)行操作。觀察、測(cè)試和分析均重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖；用SPSS 19.0軟件對(duì)各組樣本的平均微核數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，并檢測(cè)不同處理組與陰性對(duì)照組的差異顯著性[11，12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 渭河寶雞段水質(zhì)污染狀況

由表1可知，陰性對(duì)照組微核率為0.67‰，陽(yáng)性對(duì)照組微核率為9.67‰。因不同試驗(yàn)材料監(jiān)測(cè)的結(jié)果有很大差異，故較低的微核率是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)1986年頒布的《環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》規(guī)定，作物微核率不應(yīng)高于10.00‰[7，13]，本研究中，各試驗(yàn)組的微核率都在10.00‰以下，符合污染檢測(cè)要求。渭河寶雞段各水樣處理蠶豆根尖后，都出現(xiàn)了不同程度的微核（圖1），上游水樣處理組的微核率為1.23‰，污染指數(shù)是1.84，為輕度污染；中游水樣處理組的微核率為1.65‰，污染指數(shù)是2.46，為中度污染；下游水樣處理組的微核率為1.74‰，污染指數(shù)是2.60，為中度污染。各試驗(yàn)組的微核率都明顯高于陰性對(duì)照組，且上游、中游至下游蠶豆根尖微核率和污染指數(shù)都呈上升趨勢(shì)。用SPSS 19.0軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，上游水樣微核率顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.05），中、下游水樣微核率都極顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.01）。endprint

2.2 過(guò)氧化氫、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的變化

植物在逆境脅迫或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧（ROS）的積累，H2O2便是活性氧之一。由圖2可知，蠶豆胚根陰性和陽(yáng)性對(duì)照組H2O2含量分別為1.335和7.463 mmol/g；上游、中游和下游水樣蠶豆胚根的H2O2含量分別為2.442、3.456和4.578 mmol/g。上游和中游水樣蠶豆胚根的H2O2含量顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.05）；下游水樣H2O2含量極顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.01）。

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，測(cè)定其含量可以評(píng)價(jià)質(zhì)膜受損程度。陰性和陽(yáng)性對(duì)照組蠶豆胚根的MDA含量分別為7.153和23.792 nmol/mg；上游、中游和下游水樣蠶豆胚根的MDA含量分別為8.873、12.962和18.357 nmol/mg。上游水樣蠶豆胚根的MDA含量與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異，中游和下游水樣MDA含量顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.05）。

陰性和陽(yáng)性對(duì)照組蠶豆胚根的SOD活性分別為653和706 U/g蛋白；上游、中游和下游水樣蠶豆胚根的SOD活性分別為732、861和753 U/g。上游和下游水樣SOD含量與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異，中游水樣SOD含量極顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.01）。

3 小結(jié)與討論

微核的形成體現(xiàn)了環(huán)境的污染狀況，反映了細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷的程度，而遺傳物質(zhì)損傷又是機(jī)體癌變的原因之一，因此微核試驗(yàn)被認(rèn)為是反映機(jī)體接觸“三致”物質(zhì)的敏感指標(biāo)之一[5，14]。蠶豆根尖對(duì)各種誘變因子反應(yīng)十分敏感，當(dāng)誘變因子劑量在一定范圍內(nèi)時(shí)，微核產(chǎn)生的數(shù)量與誘變因子的劑量呈正比。Dong等[15]認(rèn)為焦化廢水可誘導(dǎo)蠶豆和大麥根尖細(xì)胞產(chǎn)生微核，并呈劑量依賴關(guān)系，且蠶豆比大麥更靈敏。Shahid等[16]用土壤中的有機(jī)金屬混合物來(lái)培養(yǎng)蠶豆，檢測(cè)其微核率，確定土壤的質(zhì)量和其對(duì)植物的遺傳毒性。趙志國(guó)等[17]利用蠶豆根尖微核技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)江涪陵段水質(zhì)，以不同取水點(diǎn)對(duì)蠶豆根尖進(jìn)行染毒處理，表明長(zhǎng)江涪陵段水質(zhì)受到了不同程度的污染，靠近城區(qū)和工廠附近的污染尤其嚴(yán)重。沒(méi)有細(xì)胞的分裂活動(dòng)，即使毒性很強(qiáng)的遺傳毒物，也無(wú)法通過(guò)染色體畸變、微核等細(xì)胞遺傳學(xué)的手段監(jiān)測(cè)[18]，所以在利用細(xì)胞遺傳毒理學(xué)進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，必須保證測(cè)試材料具有一定的細(xì)胞分裂水平，這是正確檢測(cè)的必要條件。

近年來(lái)植物毒性試驗(yàn)作為一種對(duì)環(huán)境污染物毒性檢測(cè)和評(píng)價(jià)的方法越來(lái)越受到人們的關(guān)注，本研究以蠶豆為材料，研究了污水對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率、H2O2、MDA含量及SOD活性的影響，旨在為污水的毒性檢測(cè)、安全排放及生物監(jiān)控指標(biāo)的確定提供一定的理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明，在污水成分的脅迫下蠶豆胚根生長(zhǎng)發(fā)育異常，出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、褐化、彎曲生長(zhǎng)、根尖壞死等癥狀。通過(guò)檢測(cè)，H2O2和MDA都呈升高趨勢(shì)，這與徐秋曼等[19]、劉會(huì)杰等[20]的研究結(jié)果一致。即隨著水污染程度加重，H2O2等活性氧（ROS）積累，未被及時(shí)清除的過(guò)量H2O2等ROS作用于DNA分子而導(dǎo)致染色體斷片，進(jìn)而形成微核。MDA升高則意味著細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度增加，膜損傷加劇。本研究中SOD活性先升后降，這可能與抗氧化酶參與污水脅迫的抵抗有關(guān)，是植物體對(duì)外界環(huán)境變化的一種響應(yīng)。

試驗(yàn)所取渭河寶雞段上、中、下游水樣的污染程度表現(xiàn)為下游=中游﹥上游，即渭河水流經(jīng)寶雞市之前就已有一定程度的污染，流經(jīng)該市區(qū)時(shí)，河水又受到了污染。這與水樣所處地理位置、沿途接納兩岸工農(nóng)業(yè)廢水和生活污水有關(guān)。通過(guò)對(duì)渭河寶雞段水樣的檢測(cè)表明，水體中具有一定的遺傳毒性，可顯著誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的上升。造成此種結(jié)果的原因是在林家村水壩（上游）附近，農(nóng)業(yè)種植面積較大，農(nóng)業(yè)種植施用化肥及農(nóng)村養(yǎng)殖造成的污染加??；在渭河大橋（中游）和潘家灣大橋（下游），由于造紙、化工等工廠集中，受工業(yè)廢水的影響，水中化學(xué)成分十分復(fù)雜，水質(zhì)進(jìn)一步下降。且由于居民區(qū)集中，一些配套污水管網(wǎng)和污水處理設(shè)施建設(shè)滯后，生活污水處理達(dá)標(biāo)率低。生活污水和垃圾較多，對(duì)水體污染程度較高。盡管水流自身具有自凈能力，但枯水期生態(tài)水嚴(yán)重不足，造成生態(tài)基流短缺，水體自凈能力難以充分發(fā)揮，直接影響渭河水質(zhì)。

渭河作為關(guān)中地區(qū)的“母親河”，影響著關(guān)中地區(qū)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，而人類的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)、生活活動(dòng)也影響著渭河水質(zhì)的變化，水污染又會(huì)間接威脅到人們的健康。改善渭河流域水生態(tài)環(huán)境，是貫徹落實(shí)黨中央、國(guó)務(wù)院提出的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展戰(zhàn)略的客觀要求，對(duì)于渭河流域經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，各部門聯(lián)合作戰(zhàn)，對(duì)渭河寶雞市區(qū)段實(shí)施改造、提升，進(jìn)行渭河綜合治理、河道生態(tài)治理，旨在建立親水、生態(tài)、環(huán)保、景美的新河道。

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