呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎患者血與痰標(biāo)本中分離的鮑曼不動(dòng)桿菌分子流行病學(xué)分析

王露霞，鄭英俊， 郭振輝，李 理， 王曉雅， 李建勛， 卓 超

鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床重要條件致病菌，具有容易獲得耐藥性及傳播的特點(diǎn)。感染類型包括醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）、尿路感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、創(chuàng)口感染、菌血癥等，尤以呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（VAP）最常見(jiàn)。一項(xiàng)亞太地區(qū)有關(guān)HAP/VAP流行病學(xué)調(diào)查（ANSORP）表明鮑曼不動(dòng)桿菌的分離率在HAP/VAP居于前3位，約20%～40%，其中中國(guó)HAP/VAP的分離率都居第1位，分別為16.2%和35.7%，且?guī)缀跞珵槎嘀啬退幹辏瑢?duì)碳青霉烯類耐藥率超過(guò)50%[1]。鮑曼不動(dòng)桿菌HAP/VAP合并血流感染帶給臨床更大的挑戰(zhàn)，其病死率高于單純HAP患者，并且鮑曼不動(dòng)桿菌性肺炎繼發(fā)血流感染的病死率（35.6%）也高于其他原因所致的鮑曼不動(dòng)桿菌血流感染病死率（7.3%）[2]。鮑曼不動(dòng)桿菌HAP進(jìn)展為HAP合并血流感染的機(jī)制并不清楚，雖然有報(bào)道提示，初始不恰當(dāng)?shù)目股刂委?、?yán)重的基礎(chǔ)疾病等臨床危險(xiǎn)因素可導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌HAP進(jìn)展為菌血癥[3-4]，但有關(guān)病原學(xué)本身在其中所起作用卻鮮有報(bào)道。為此，本研究通過(guò)對(duì)照研究，從鮑曼不動(dòng)桿菌的分子流行病學(xué)特征入手，研究病原學(xué)在鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎進(jìn)展到合并血流感染中所起作用，為臨床早期防控鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

所有菌株來(lái)自2015年6－12月入住我院ICU、內(nèi)科（M）ICU VAP患者痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)分離出的鮑曼不動(dòng)桿菌，剔除來(lái)自同一患者同一標(biāo)本的重復(fù)菌株。3株參考菌株：不動(dòng)桿菌基因種型13TU（Acinetobacter nosocomialis）、不動(dòng)桿菌基因種型3（Acinetobacter pittii）和鮑曼不動(dòng)桿菌由浙江大學(xué)邵逸夫醫(yī)院俞云松教授惠贈(zèng)。

1.2 研究方法

1.2.1 病例分組和診斷標(biāo)準(zhǔn) 入選患者符合美國(guó)ATS/IDSA 2005年HAP/VAP診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。若患者符合相隔48 h內(nèi)出現(xiàn)血培養(yǎng)及痰培養(yǎng)鮑曼不動(dòng)桿菌陽(yáng)性兩個(gè)條件，且血培養(yǎng)陽(yáng)性為雙瓶以上，歸為VAP合并血流感染組，稱A組；若患者血培養(yǎng)為陰性，僅痰培養(yǎng)出鮑曼不動(dòng)桿菌為B組（鮑曼不動(dòng)桿菌呼吸感染/定植）。若患者血培養(yǎng)有鮑曼不動(dòng)桿菌以外的細(xì)菌則不納入本研究分析。

1.2.2 臨床資料收集 查閱患者臨床資料、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)兩組患者基本信息，入住ICU、MICU時(shí)間，是否接受侵襲性操作以及采取痰或血標(biāo)本日期±1 d的各項(xiàng)臨床征象等指標(biāo)。

1.2.3 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 菌株鑒定及藥敏采用全自動(dòng)微生物系統(tǒng)VITEK 2-Compact儀器（法國(guó)生物梅里埃公司）。有關(guān)鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體中3個(gè)基因型（13TU、不動(dòng)桿菌基因種型3和鮑曼不動(dòng)桿菌）的鑒定則參照文獻(xiàn)[6]方法以16S-23S rRNA予以分類 。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 參照文獻(xiàn) [7]：制備膠塊、裂解細(xì)胞、洗膠、膠塊DNA酶切、加樣、電泳等；①條帶完全相同判斷為克隆株；②條帶差異1～3條判斷為克隆亞型；③條帶差異4～6條判斷為可能克隆亞型；④條帶差異大于7條以上判斷為非克隆株。用生物學(xué)軟件 BioNumerics結(jié)合肉眼比對(duì)將PFGE 結(jié)果進(jìn)行非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

1.2.5 多位點(diǎn)序列分型（MLST） 分析提取細(xì)菌DNA模板，參照文獻(xiàn)報(bào)道制定的MLST引物設(shè)計(jì)方案[8]，PCR擴(kuò)增gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi、rpoD共7個(gè)管家基因，引物見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)物序列與鮑曼不動(dòng)桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubmlst.org/abaumannii/info/primers.sht）進(jìn)行比對(duì)。若MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中查找不到測(cè)序結(jié)果所得到的ST型，經(jīng)核實(shí)后，確認(rèn)為新的ST型，新的管家基因序列和ST型及菌株相關(guān)資料上傳到數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用WHONET 5.6進(jìn)行藥敏數(shù)據(jù)分析，采用SPSS17.0進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，不同分類構(gòu)成比的計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析采用COX回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 管家基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences for housekeeping genes and the corresponding product size

2 結(jié)果

2.1 菌株分型及相關(guān)臨床信息

入選A組患者14例，獲得鮑曼不動(dòng)桿菌非重復(fù)菌株28株（同一患者血和痰標(biāo)本各計(jì)1株）；入選B組28例患者僅痰培養(yǎng)出鮑曼不動(dòng)桿菌，獲得非重復(fù)菌株28株。由于在臨床實(shí)際工作中無(wú)法通過(guò)常規(guī)的方法鑒別鮑曼不動(dòng)桿菌的種屬，故統(tǒng)一報(bào)告為鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體，借助16S-23S rRNA基因間區(qū)特征進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。A組28株菌中，有26株菌16S-23S rRNA基因間區(qū)序列比對(duì)結(jié)果與鮑曼不動(dòng)桿菌相似度大于99%，鑒定確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌；2株菌與Acinetobector pittii相似度大于99%，確認(rèn)為Acinetobector pittii。B組28株菌中，有26株菌鑒定確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌，1株菌為Acinetobector pittii， 1株菌為Acinetobector nosocomialis。臨床信息顯示，A組入住ICU的天數(shù)為（18.93±17.00）d，14-day死亡14例（50.0%）；B組的入住ICU天數(shù)為（21.61±13.80） d，14-day死亡4例（14.3%）。其余臨床征象指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

兩組鮑曼不動(dòng)桿菌體外對(duì)10種抗菌藥物的耐藥率均達(dá)到50.0%～100%，僅替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌有較好的抗菌活性。兩組間藥物敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 菌株P(guān)FGE 分析

A組14例患者的各自血與痰標(biāo)本分離株均為同一克??；28株菌株分為6個(gè)克隆型， A、B、C、D、E、F型克隆株分別為8株、6株、4株、4株、4株、2株； B組28株分為9個(gè)克隆型，其中包括A組中A-E 5個(gè)克隆型，共21株，其余7株為G型（3株）、H型（2株）、J型（1株）和K型（1株）。

2.4MLST分型

56株鮑曼不動(dòng)桿菌通過(guò)MLST分為13個(gè)ST型，其中ST 195、ST 208、ST 457、ST N2構(gòu)成比分別為28.57%、19.05%、11.90%、14.29%，為主要流行株。有5個(gè)新的ST型（分別以N1、N2、N3、N4和N5表示），其已知ST型僅有1個(gè)或2個(gè)管家基因的差別，親緣關(guān)系較近，多見(jiàn)于管家基因gpi和gyrB的差異。A組與B組的ST 195、ST 208、ST 457、ST N2主要流行株的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ ?0.05）。見(jiàn)表4。

表2 A組與B組各項(xiàng)臨床指標(biāo)對(duì)照比較Table 2 Clinical data compared between patients with A. baumannii isolates from blood and sputum and those with A. baumannii isolates only from sputum

表3 兩組分離鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥率比較Table 3 Antimicrobial resistance rates of Acinetobacter baumannii isolates compared in terms of specimen source

2.5MLST分型同源性分析

結(jié)合分型結(jié)果和PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)，使用eBURST軟件進(jìn)行菌株基因同源性分析，56株鮑曼不動(dòng)桿菌共發(fā)現(xiàn)13個(gè)ST型，其中7個(gè)ST型（ST 195、ST 208、ST 457、ST 369、ST N1、ST N2、ST N5）屬于克隆復(fù)合體92（clonal complex 92，CC92），CC92不同ST型關(guān)系進(jìn)化見(jiàn)圖1，CC92占所有菌株的83.3%。屬于同一個(gè)克隆復(fù)合體的各個(gè)ST型之間僅有1個(gè)或2個(gè)管家基因的差別，親緣關(guān)系較近，多見(jiàn)于管家基因gpi和gyrB的差異。CC92菌株比例在A組和B組中的分布，并未發(fā)現(xiàn)差異（P＞0.05），見(jiàn)表4和圖1。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是我國(guó)近年醫(yī)院感染中最常見(jiàn)的、最難治療的細(xì)菌之一。一方面，鮑曼不動(dòng)桿菌幾乎都為多重耐藥，且對(duì)碳青霉烯類耐藥率也超過(guò)50%，使臨床可選用的抗菌藥物很有限；另一方面，該菌最常見(jiàn)于患者下呼吸道，臨床很難判斷其是感染菌還是定植菌，常導(dǎo)致過(guò)度治療或治療不足的矛盾。然而，近年流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌血流感染的比例呈上升趨勢(shì)，大多繼發(fā)于HAP或VAP，而且與單純的肺炎相比，患者往往感染嚴(yán)重，病情進(jìn)展快，病死率較高[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，患者入住ICU時(shí)間、機(jī)械通氣、行連續(xù)腎臟替代療法、置中心靜脈導(dǎo)管為鮑曼不動(dòng)桿菌血流感染的危險(xiǎn)因素[9]。同時(shí)，來(lái)源于血流感染的鮑曼不動(dòng)桿菌也常表現(xiàn)為多重耐藥甚至廣泛耐藥，使臨床治療更是面臨困境。一項(xiàng)有關(guān)腫瘤患者合并廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌血癥的臨床研究顯示，63%患者在確診血流感染后給予了恰當(dāng)?shù)目咕幬铮òǘ囵ぞ兀?，?0 d病死率仍然達(dá)到83.7%，且死亡原因主要與感染嚴(yán)重有關(guān)[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于VAP合并血流感染組患者的14 d病死率達(dá)50%，而未合并血流感染組患者的14 d病死率僅為14%。雖然比較兩組多項(xiàng)與血流感染有關(guān)的危險(xiǎn)因素，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但這不排除本研究樣本量較小所致的統(tǒng)計(jì)偏倚。

表4 A組與B組各ST型分布比較Table 4 Distribution of ST types compared between Acinetobacter baumannii strains in terms of specimen source

圖1 56株鮑曼不動(dòng)桿菌基因同源性分析結(jié)果Figure 1 Analysis of the genetic homology for 56 strains of Acinetobacter baumannii

有關(guān)鮑曼不動(dòng)桿菌血流感染的危險(xiǎn)因素多集中于宿主因素分析，而關(guān)于病原學(xué)分子特征的分析報(bào)道較少。Chuang 等[11]分析了鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體中3個(gè)種類致菌血癥患者的臨床特征，發(fā)現(xiàn)多重耐藥株多出現(xiàn)于鮑曼不動(dòng)桿菌，而且患者的病死率也高于種型13TU和種型3。本研究也得到類似結(jié)論，A組和B組菌株幾乎都屬于鮑曼不動(dòng)桿菌，而且多為多重耐藥株。為此，進(jìn)一步對(duì)兩組鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行ST型分析，發(fā)現(xiàn)ST 195、ST 208、ST 457、ST N2型占到了總菌株數(shù)的73.8%，為主要流行株。而既往報(bào)道，ST195及ST457也正是廣東省鮑曼不動(dòng)桿菌最常見(jiàn)的ST型序列[12]，由此也提示，主流克隆株的長(zhǎng)期存在是導(dǎo)致臨床鮑曼不動(dòng)桿菌感染/定植高發(fā)的重要原因。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩組中ST型分布無(wú)差異，均以ST 195、ST 457、ST N2為主要ST型，eBURST分析顯示這幾種ST型屬于CC92， CC92不僅在國(guó)內(nèi)表現(xiàn)為主要的流行克隆復(fù)合體，同時(shí)也呈現(xiàn)全球范圍流行趨勢(shì)[13-14]。CC92群中兩個(gè)管家基因gpi和gyrB容易突變，衍生更多的新亞型，如本研究發(fā)現(xiàn)的STN1、STN2和STN5。因此，加強(qiáng)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌CC92克隆的主動(dòng)監(jiān)控，防止其在病區(qū)內(nèi)傳播，對(duì)于降低鮑曼不動(dòng)桿菌感染和病死率尤為重要。

總之，通過(guò)對(duì)照研究，分析鮑曼不動(dòng)桿菌在肺炎合并血流感染中，細(xì)菌分子流行病學(xué)特征，結(jié)果表明，本研究并未發(fā)現(xiàn)國(guó)外報(bào)道的高毒力鮑曼不動(dòng)桿菌ST10型菌株[15]，本院鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎合并血流感染仍以CC92流行克隆為主。而宿主方面的病情程度是合并血流感染的主要危險(xiǎn)因素。

[1]KIM UJ， KIM HK， AN JH，et al. Update on the epidemiology，treatment， and outcomes of carbapenem-resistant Acinetobacter infections[J]. Chonnam Med J，2014，50（2）：37-44.

[2]CHUNG DR， SONG JH， KIM SH，et al. High prevalence of multidrug-resistant nonfermenters in hospital-acquired pneumonia in Asia[J]. Am J Respir Crit Care Med，2011， 184（12）：1409-1417.

[3]MAGRET M， LISBOA T， MARTIN-LOECHES I，et al.Bacteremia is an independent risk factor for mortality in nosocomial pneumonia： a prospective and observational multicenter study[J]. Crit Care，2011，15（1）：R62.

[4]LEE HY， CHEN CL， WU SR， et al. Risk factors and outcome analysis of Acinetobacter baumannii complexbacteremia in critical patients[J]. Crit Care Med， 2014 ，42（5）：1081-1088.

[5]American Thoracic Society， Infectious Diseases Society of America. Guidelines for the management of adults with hospitalacquired， ventilator-associated， and healthcare-associated pneumonia[J]. Am J Respir Crit Care Med， 2005 ，171（4）：388-416.

[6]LIN YC， SHENG WH， CHANG SC， et al. Application of a microsphere-based array for rapid identification of Acinetobacter spp. with distinct antimicrobial susceptibilities[J]. J Clin Microbiol， 2008，46（2）：612-617.

[7]TENOVER FC， ARBEIT RD，GOERING RV， et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis： criteria for bacterial strain typing[J]. J Clin Microbiol，1995 ，33（9）：2233-2239.

[8]BARTUAL SG，SEIFERT H，HIPPLER C，et al. Development of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J]. J Clin Microbiol，2005，43（9）：4382-4390.

[9]周泓羽，袁喆，杜渝平，等. 鮑氏不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染危險(xiǎn)因素的薈萃分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23（2）：295-297.

[10]FREIRE MP， DE OLIVEIRA GARCIA D， GARCIA CP，et al. Bloodstream infection caused by extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii in cancer patients： high mortality associated with delayed treatment rather than with the degree of neutropenia[J]. Clin Microbiol Infect，2016，22（4）：352-358.

[11]CHUANG YC， SHENG WH， LI SY， et al. Influence of genospecies of Acinetobacter baumannii complex on clinical outcomes of patients with Acinetobacter bacteremia[J]. Clin Infect Dis，2011，52（3）：352–360.

[12]林倍州. 細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)分析暨重癥監(jiān)護(hù)病房HAP合并鮑曼不動(dòng)桿菌血流感染臨床分析及分子流行病學(xué)調(diào)查[D]. 廣州醫(yī)科大學(xué)，2015.

[13]ZHONG Q，XU W，WU Y， et al. Clonal spread of carbapenem nonsusceptible Acinetobacter baumannii in an intensive care unit in a teaching hospital in China[J]. Ann Lab Med，2012，32（6）：413-419.

[14]HE C，XIE Y，F(xiàn)AN H， et al. Spread of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii of European clone II in western China[J]. Int J Antimicrob Agents，2011，38（3）：257-260.

[15]OU HY， KUANG SN， HE X， et al. Complete genome sequence of hypervirulent and outbreak-associated Acinetobacter baumannii strain LAC-4 ： epidemiology， resistance genetic determinants and potential virulence factors[J]. Sci Rep， 2015 ，5：8643.