豐富環(huán)境對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)功能的影響

徐丹 陶陶 張繼榮 何桂雙

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的病理生理基礎(chǔ)，運(yùn)動(dòng)、言語(yǔ)、行為及認(rèn)知功能障礙均為腦缺血后常見(jiàn)的并發(fā)癥。認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)為注意力不集中，學(xué)習(xí)記憶能力下降，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。腦缺血后行為功能及認(rèn)知能力的恢復(fù)不僅受生理、病理因素的影響，還與環(huán)境因素密切相關(guān)[1]。近年來(lái)，豐富環(huán)境作為一種新的康復(fù)治療手段在腦血管疾病中的作用成為研究的熱點(diǎn)。

豐富環(huán)境是指能促進(jìn)感覺(jué)、認(rèn)知及行為能力提高的居住條件，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境而言，其設(shè)置復(fù)雜而新穎，包括社會(huì)交往及生存環(huán)境兩方面因素[2]。自豐富環(huán)境這一概念被提出以來(lái)，就主要用來(lái)研究各種腦損傷動(dòng)物模型，最新的臨床研究顯示豐富環(huán)境對(duì)腦卒中患者的神經(jīng)功能恢復(fù)也表現(xiàn)出積極作用[3]。豐富環(huán)境可能通過(guò)調(diào)控受損腦組織內(nèi)各種因子的表達(dá)而部分逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增加覓食行為，促進(jìn)腦功能修復(fù)[4]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factors， BDNF)作為活性最強(qiáng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在腦血管疾病中發(fā)揮重要的作用。本研究通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注模型，采用豐富環(huán)境干預(yù)研究大鼠海馬CA1區(qū)BDNF蛋白的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討豐富環(huán)境對(duì)認(rèn)知及神經(jīng)功能恢復(fù)可能的作用機(jī)制，旨在為臨床治療提供更客觀可靠的依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量280～300 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)批號(hào)：SCXK(黔)2016-0001。動(dòng)物的使用符合貴州省動(dòng)物管理委員會(huì)管理?xiàng)l例。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)、腦缺血組(20只)及豐富環(huán)境組(20只)。

1.2主要試劑與儀器包括兔抗BDNF抗體(購(gòu)于瑞士Roche公司)、免疫熒光試劑盒(購(gòu)于武漢博士德公司)、Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司生產(chǎn))、分析軟件(Image J)。

1.3方法

1.3.1造模：參照 Longa法[5]建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebra artery occlusion)再灌注模型，具體操作如下：按體質(zhì)量0.35 mL/100 g給予大鼠10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛腹腔注射，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切口，鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈起始處放置小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉血流，在頸總動(dòng)脈剪一小口插入直徑約為0.20 mm的尼龍線栓，將線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔插入直到感覺(jué)到輕微阻力(插入長(zhǎng)度自頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處約18 cm)，提示線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處。缺血90 min后，再次麻醉大鼠，緩慢拔出線栓，縫合頸部切口，即完成大鼠腦缺血90 min 再灌注損傷模型。待動(dòng)物蘇醒后觀察其步態(tài)和行為，參照Longa法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]判斷模型是否制備成功，1～3分視為造模成功，剔除造模失敗或死亡的大鼠，用備用大鼠補(bǔ)齊數(shù)量。假手術(shù)組線栓不插入大腦中動(dòng)脈，其余操作相同。

1.3.2豐富環(huán)境設(shè)置：將假手術(shù)組和腦缺血組大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：將大鼠置于25 cm×15 cm×18 cm的塑料籠內(nèi)，籠內(nèi)只有食物、墊料和水，每籠2只；豐富環(huán)境組大鼠于造模后立即飼養(yǎng)在豐富環(huán)境：將大鼠置于45 cm×25 cm×28 cm的金屬網(wǎng)格籠內(nèi)，籠內(nèi)除食物、墊料和水外，還有一個(gè)木房子、木制高臺(tái)、積木、轉(zhuǎn)輪、兵乓球、小積木以及小的玩具，每周更換1次；同時(shí)播放輕音樂(lè)，以不同顏色燈光照射，每天持續(xù)2 h，每籠5只，豐富環(huán)境干預(yù)30 d。

1.3.3神經(jīng)功能缺損評(píng)分：參照 Longa法[5]于豐富環(huán)境干預(yù)的第1天及第30天對(duì)各組大鼠行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組取3只，腦缺血組和豐富環(huán)境組各取6只大鼠。神經(jīng)功能缺損由輕到重分為5級(jí)(0～4分)。0分：正常，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸直對(duì)側(cè)前肢(即提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)；2分：行走時(shí)軀體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：行走時(shí)軀體向偏癱側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.3.4腦組織BDNF蛋白表達(dá)檢測(cè)：分別于豐富環(huán)境干預(yù)的第1天以及第30天行神經(jīng)功能評(píng)分后用免疫熒光染色法檢測(cè)各組大鼠腦組織海馬區(qū)BDNF蛋白的表達(dá)。具體過(guò)程如下：取各組大鼠腦組織制作冷凍切片，切片經(jīng)0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，經(jīng)BSA封閉液室溫封閉20 min，滴加兔抗BDNF抗體(1∶100)，置濕盒中4℃避光孵育過(guò)夜，第2天經(jīng)上午0.01 mol/L PBS清洗切片3次，每次5 min，滴加紅色熒光標(biāo)記的二抗，濕盒內(nèi)避光孵育1 h。隨后滴加抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片，立即置于熒光顯微鏡下觀察。于200倍視野下統(tǒng)計(jì)缺血側(cè)海馬CA1區(qū)熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，每張切片隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)視野，攝片保存，計(jì)算平均值，用Image J軟件分析。

1.3.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：Morris水迷宮主要由內(nèi)含平臺(tái)的圓形水池和記錄裝置兩部分組成。水池直徑120 cm、高50 cm。池壁上標(biāo)有東、南、西、北4個(gè)入水點(diǎn)，將水池分為4個(gè)象限。內(nèi)置直徑14 cm、高20 cm的平臺(tái)，加水至超過(guò)平臺(tái)高度1～1.5 cm，為避免大鼠直接看見(jiàn)平臺(tái)，在水中加入墨水，水溫保持在22～24℃。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并記錄游泳軌跡。于豐富環(huán)境干預(yù)30 d后進(jìn)行連續(xù)5 d的水迷宮實(shí)驗(yàn)。前4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄各組大鼠的逃避潛伏期；第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄90 s內(nèi)大鼠跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。測(cè)試時(shí)避光、保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)良好通風(fēng)，周圍參照物固定不變。研究人員保持安靜，不要隨意走動(dòng)。測(cè)試完畢后用干毛巾擦拭大鼠，并置于暖風(fēng)旁，注意保暖。以大鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)作為評(píng)價(jià)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，資料服從正態(tài)分布且方差齊時(shí)應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)正常，無(wú)異常行為；豐富環(huán)境干預(yù)的第1天腦缺血組和豐富環(huán)境組大鼠均可見(jiàn)缺血再灌注損傷后異常行為，如行走時(shí)轉(zhuǎn)圈或向?qū)?cè)傾倒，神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；豐富環(huán)境干預(yù)的第30天，豐富環(huán)境組大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀較腦缺血組明顯減輕(P<0.05)，而腦缺血組大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2各組腦組織BDNF蛋白表達(dá)假手術(shù)組大鼠BDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較少；豐富環(huán)境干預(yù)的第1天腦缺血組和豐富環(huán)境組大鼠海馬BDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較假手術(shù)組相比明顯升高(P<0.05)；但腦缺血組與豐富環(huán)境組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。豐富環(huán)境干預(yù)的第30天時(shí)腦缺血組和豐富環(huán)境組大鼠BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，但豐富環(huán)境組BDNF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)明顯多于腦缺血組(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。

2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)與假手術(shù)組相比較，豐富環(huán)境組和腦缺血組大鼠的逃避潛伏期延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)減少(均P<0.05)；與腦缺血組相比，豐富環(huán)境組逃避潛伏期縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增多(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠造模術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分和BDNF蛋白表達(dá)情況比較(±s)

注：BDNF：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，圖1同；與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦缺血組比較，bP<0.05

圖 1 豐富環(huán)境干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠BDNF熒光表達(dá)情況(×200)

組別n逃避潛伏期(秒)穿越平臺(tái)次數(shù)第1天第2天第3天第4天第5天假手術(shù)組452.91±13.2143.28±10.5231.54±15.7622.73±12.937.8±0.52腦缺血組878.12±10.98a63.29±13.81a54.06±12.88a44.17±15.42a3.7±0.16a豐富環(huán)境864.75±14.97ab52.08±11.72ab38.21±16.23ab26.09±8.79ab5.9±0.38abF值5.253.773.825.63204.56P值0.01680.04410.04260.01320.0000

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與缺血組相比，bP<0.05

3 討論

豐富環(huán)境于1947年被Hebb提出，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[6]，不同于一般的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，豐富環(huán)境往往具有更大的空間和更復(fù)雜多變的環(huán)境，而且還能增加動(dòng)物之間的行為交流。豐富環(huán)境與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境的設(shè)置在不同的實(shí)驗(yàn)室不盡相同，但總的原則是要增加社會(huì)性刺激及動(dòng)物之間相互交往的機(jī)會(huì)[7]。

本研究于豐富環(huán)境干預(yù)的第1天及第30天對(duì)各組大鼠行神經(jīng)功能缺損評(píng)分發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)功能缺損，腦缺血組和豐富環(huán)境組大鼠在術(shù)后早期即有神經(jīng)缺損癥狀，且兩組神經(jīng)缺損評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示腦缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響大鼠的神經(jīng)功能；豐富環(huán)境干預(yù)30 d后，豐富環(huán)境組大鼠神經(jīng)缺損癥狀有明顯改善，神經(jīng)功能缺損評(píng)分較腦缺血組降低，表明豐富環(huán)境對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)行為恢復(fù)有積極作用。這與賈子尚等[8]研究報(bào)道結(jié)果一致。推測(cè)豐富環(huán)境通過(guò)復(fù)雜而又新穎的環(huán)境信息，激發(fā)大鼠探索學(xué)習(xí)的能力，并且增加動(dòng)物之間的社會(huì)交往而改變自身行為，適應(yīng)新的環(huán)境，從而提高行為能力。

水迷宮實(shí)驗(yàn)是公認(rèn)的檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力有效的最常用手段，該研究結(jié)果顯示，干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)，腦缺血組及豐富環(huán)境組大鼠的逃避潛伏期較假手術(shù)組延長(zhǎng)、跨越平臺(tái)次數(shù)降低，表明腦缺血再灌注損傷對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生負(fù)面影響。經(jīng)豐富環(huán)境干預(yù)后大鼠的逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)均明顯優(yōu)于腦缺血組，且隨著對(duì)周圍環(huán)境的熟悉及學(xué)習(xí)記憶能力的增強(qiáng)，第4天的逃避潛伏期接近假手術(shù)組，提示豐富環(huán)境能提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與豐富環(huán)境可促進(jìn)受損神經(jīng)組織功能修復(fù)有關(guān)。

BDNF屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，是1982年首次從豬腦中發(fā)現(xiàn)的一種廣泛分布于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的二聚體蛋白，在海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)表達(dá)最多[9]。在所有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子成員中，BDNF的活性作用最強(qiáng)，通過(guò)神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)恢復(fù)兩方面發(fā)揮腦保護(hù)作用。發(fā)生腦缺血再灌注損傷的同時(shí)，機(jī)體自身會(huì)形成自我保護(hù)機(jī)制，內(nèi)源性BDNF的表達(dá)增加可能是其中之一[10-11]。Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)降低BDNF水平可加重動(dòng)物的腦損傷。而徐愛(ài)華等[13]研究證實(shí)在損傷早期給予外源性BDNF能夠補(bǔ)充缺乏的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，增加突觸可塑性，改善認(rèn)知功能障礙。由于BDNF是大分子蛋白，不能很好地通過(guò)血-腦屏障，明顯降低了外源性BDNF的藥效。若直接行側(cè)腦室注射不僅會(huì)破壞頭顱骨，而且需精準(zhǔn)定位，操作難度較高，可能會(huì)加重大鼠的腦損傷[14]。因此通過(guò)其他干預(yù)來(lái)提高內(nèi)源性BDNF的表達(dá)意義重大。

本研究通過(guò)對(duì)豐富環(huán)境干預(yù)的第1天及第30天檢測(cè)各組大鼠腦海馬區(qū)BDNF蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示假手術(shù)組的BDNF蛋白表達(dá)較少，豐富環(huán)境干預(yù)的第1天，腦缺血組和豐富環(huán)境組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于假手術(shù)組，提示大腦受到損傷時(shí)可通過(guò)上調(diào)BDNF的表達(dá)而啟動(dòng)內(nèi)源性腦保護(hù)機(jī)制。豐富環(huán)境干預(yù)的第30天發(fā)現(xiàn)，腦缺血組和豐富環(huán)境組BDNF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量降低，但豐富環(huán)境組高于腦缺血組，表明腦缺血再灌注損傷后內(nèi)源性的BDNF增加有限，而豐富環(huán)境可增加海馬區(qū)內(nèi)源性BDNF的表達(dá)，這可能部分解釋豐富環(huán)境干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀改善及學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)的原因。 這與Fan等[15]研究結(jié)果一致。

綜上所述，豐富環(huán)境可上調(diào)腦缺血再灌注損傷引起的內(nèi)源性BDNF的表達(dá)而快速啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，改善神經(jīng)功能，提高學(xué)習(xí)記憶能力。豐富康復(fù)的腦保護(hù)作用可能是多種因素綜合作用的結(jié)果，有關(guān)具體機(jī)制還需要更加深入的研究。在傳統(tǒng)藥物治療的基礎(chǔ)上結(jié)合豐富環(huán)境治療可能使腦卒中患者受益。

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