鴨甲肝病毒3型在人工感染雛鴨體內(nèi)分布與誘導(dǎo)肝病變及細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析

朱玉東，汪銘書,3，程安春,3*，朱德康,3，賈仁勇,3，劉馬峰,3，陳 舜,3，趙新新,3，楊 喬,3，吳 英,3，陳孝躍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130)

鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)是引起鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis)的病原之一，主要感染4周以內(nèi)雛鴨，死亡雛鴨表現(xiàn)為肝腫脹、出血等特點(diǎn)。目前，DHAV劃分為3個(gè)基因型[1]：DHAV-1在世界范圍內(nèi)分布，DHAV-2主要發(fā)生于我國臺(tái)灣地區(qū)[2]，DHAV-3分布在我國大陸地區(qū)[3-5]、韓國[6-7]和越南[8]。近年來，DHAV-3的流行呈現(xiàn)擴(kuò)展趨勢(shì)[8-15]，給鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅。

DHAV-3感染發(fā)病雛鴨很難通過臨床癥狀和剖檢變化與DHAV-1感染發(fā)病雛鴨進(jìn)行區(qū)分，但可通過血清學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒別診斷。目前已建立多種可鑒別DHAV-1和DHAV-3的RT/rRT-PCR和免疫組化的方法并廣泛應(yīng)用到DHAV增殖規(guī)律的研究中[15-19]。DHAV在雛鴨體內(nèi)增殖除由病毒自身特性決定外，還受初始感染劑量[18]、感染途徑[20]、雛鴨日齡[21]、雛鴨種系[22]等多種因素影響。DHAV在雛鴨體內(nèi)具有廣泛的組織嗜性，但各組織病毒含量不同。普遍認(rèn)為肝是DHAV增殖的最佳靶器官，其致病機(jī)制尚不清楚。張煥榮等[16]認(rèn)為DHAV-1弱毒進(jìn)入雛鴨肝后，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子表達(dá)量上調(diào)，而其中干擾素(主要是IFN-α)轉(zhuǎn)錄水平的升高抑制了病毒增殖。C. Q. Gu等[23]研究表明DHAV-1 JX株感染24 h后病毒維持高水平，肝中細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-10)表達(dá)量受到明顯抑制。而C. P. Song等[24]檢測(cè)結(jié)果表明DHAV-1強(qiáng)毒和弱毒均能誘導(dǎo)肝中多種細(xì)胞因子表達(dá)量上調(diào)，但上調(diào)程度不同，強(qiáng)毒誘導(dǎo)IFN-γ和IL-2的表達(dá)量上調(diào)更明顯。目前尚未見DHAV-3在肝中致病機(jī)制的研究報(bào)道。本研究建立DHAV-3強(qiáng)毒人工感染7日齡雛鴨模型，并對(duì)病毒在雛鴨體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布及誘導(dǎo)肝組織病變和細(xì)胞因子(IFN-α/β/γ和IL-1β/2/6)表達(dá)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，以期為DHAV-3致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

DHAV-3 QL株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病中心分離鑒定并保存，對(duì)4日齡雛鴨的LD50=10-4.13·0.2 mL-1；1日齡北京鴨，購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)，隔離飼養(yǎng)至7日齡，參照Q. Hu等[5]和S. Mao等[25]方法檢測(cè)DHAV及母源抗體含量均為陰性。

1.2 主要儀器和試劑

CFX ConnectTMOptics Module Real-Time PCR System(Bio-Rad)；RNAiso Plus (No.: 9109) 、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(No.: RR064A)、PrimeScriptTMRT Kit(No.：RR047)購自TaKaRa；DHAV-3型引物和探針[5]由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成；6種細(xì)胞因子(IFN-α、β、γ和IL-1β、2、6)及內(nèi)參GAPDH基因引物[26]由英濰捷基公司合成。

1.3 DHAV-3人工感染7日齡雛鴨疾病模型構(gòu)建及樣品采集

77只7日齡雛鴨隨機(jī)分為試驗(yàn)組(50只)和對(duì)照組(27只)，試驗(yàn)組雛鴨腿部肌肉注射DHAV-3病毒 6×107.99copies·只-1(2 000 LD50)，對(duì)照組腿部肌肉注射生理鹽水(0.75%)0.5 mL·只-1。接毒后觀察雛鴨臨床發(fā)病和死亡情況，并于感染后1、3、6、9、12、24、48、72和96 h，在試驗(yàn)組(出現(xiàn)臨床癥狀后，選擇發(fā)病癥狀典型的雛鴨)和對(duì)照組中各采集3只雛鴨的血液、肝、脾、肺、腎、胰、法氏囊、胸腺、大腦、哈德氏腺和十二指腸，死亡雛鴨采集肝，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，未死亡雛鴨取部分肝組織固定于4%多聚甲醛中備用。

1.4 定量檢測(cè)DHAV-3含量及數(shù)據(jù)分析

根據(jù)RNAiso Plus操作說明書，提取樣品中總RNA，利用一步法TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法[5]檢測(cè)DHAV-3含量。檢測(cè)結(jié)果用Graphpad prism 6中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析并作圖。

1.5 肝組織病理學(xué)觀察及細(xì)胞因子檢測(cè)

對(duì)“1.3”保存的肝組織樣品切片進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察，用Adobe photoshop CS 6作圖對(duì)比。參照2-ΔΔCt相對(duì)定量方法[27]在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)肝中抗病毒細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β和IFN-γ及促炎因子IL-1β、IL-2和IL-6，檢測(cè)結(jié)果用Graphpad prism 6分析并作圖。

2 結(jié) 果

2.1 DHAV-3感染雛鴨的臨床發(fā)病癥狀、病理變化及死亡情況

雛鴨于感染18 h后開始出現(xiàn)癥狀，大部分雛鴨精神沉郁、扎堆，采食、飲水量明顯減少；感染24 h后開始出現(xiàn)死亡，24 h死亡6只雛鴨，30 h死亡2只，48 h死亡2只，54 h死亡1只。剖檢發(fā)病死亡雛鴨，可見肝腫大，表面分布有大量出血點(diǎn)或出血斑，質(zhì)地變脆；脾充血呈鈍圓形；腎有明顯出血現(xiàn)象；胸腺也有出血點(diǎn)。對(duì)照組雛鴨精神、采食和飲水正常，剖檢未發(fā)現(xiàn)病變。

用于單獨(dú)觀測(cè)DHAV-3致死率的雛鴨，共死亡4只(死亡率40%)，24 h死亡2只，38 h死亡1只，60 h死亡1只。雛鴨生存曲線如圖1。

圖1 致病性DHAV-3感染7日齡雛鴨的生存曲線Fig.1 Survival curves of 7-day-old ducklings after infected with virulent strain of DHAV-3

2.2 DHAV-3在雛鴨體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

DHAV-3感染7日齡雛鴨后，1 h即在所有組織器官中檢測(cè)到。但在各組織器官中含量不同，肝病毒含量最高(為106.34copies·g-1)，其次是脾、腎和血液中病毒含量，分別為105.56、105.03和105.04copies·mL-1，其余器官病毒含量均在105copies·g-1以下(圖2)。隨時(shí)間推移，所有組織和器官中病毒含量均逐漸上升，血液和胰分別于感染后12和96 h含量最高，其余組織均于24～48 h達(dá)到峰值，隨后病毒含量下降。其中，肝、脾和腎中各時(shí)間點(diǎn)DHAV-3含量明顯高于其他組織器官，感染后24 h達(dá)到峰值，分別為1011.15、1010.37和1010.30copies·g-1，48～96 h病毒含量緩慢下降(圖2A)。DHAV-3在除脾外其他免疫器官(胸腺、法氏囊、哈德氏腺)中增殖規(guī)律存在差異，胸腺中各時(shí)間點(diǎn)病毒含量高于法氏囊和哈德氏腺，而法氏囊峰值時(shí)間在感染后24 h早于胸腺和哈德氏腺峰值時(shí)間48 h(圖2B)。DHAV-3在血液組織和胰中增殖規(guī)律與其他器官不同，感染12 h后血液中病毒含量即達(dá)到峰值，為108.80copies·mL-1， 12～96 h病毒含量下降，96 h下降至105.69copies·mL-1。DHAV-3在胰中含量持續(xù)增加，感染96 h后最高，為108.33copies·g-1(圖2D)。DHAV-3在其他器官(肺、大腦、十二指腸)中增殖均在感染后24 h達(dá)到峰值，除9和12 h外各時(shí)間點(diǎn)病毒含量，十二指腸高于肺和大腦。大腦中病毒含量最低，峰值含量僅為107.66copies·g-1，感染96 h后下降至105.60copies·g-1(圖2C)。

2.3 DHAV-3在肝中增殖速度及引起的組織病理學(xué)變化

2.3.1 DHAV-3在肝中增殖速度 比較相鄰時(shí)間點(diǎn)肝中DHAV-3病毒含量，分析其含量變化及顯著性差異，以研究病毒的增殖速度。結(jié)果表明，感染1～3 h肝中病毒增殖速度最快，3 h病毒含量較1 h時(shí)有極顯著差異(P<0.01)，而在9～12 h和12～24 h有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。感染死亡雛鴨的肝病毒含量最高為1012.01copies·g-1，最低1011.05copies·g-1，平均含量為1011.47±0.37copies·g-1。

A.DHAV-3在肝、脾和腎增殖；B. DHAV-3在胸腺、法氏囊和哈德氏腺中增殖；C. DHAV-3在肺、大腦和十二指腸中增殖；D. DHAV-3在血液和胰中增殖 A. DHAV-3 proliferates in the liver, spleen and kidneys; B. DHAV-3 proliferates in thymus, bursa of Fabricius and Harderian gland; C. DHAV-3 proliferates in the lung, brain and duodenum; D. DHAV-3 proliferates in blood and pancreas圖2 DHAV-3在各組織器官中動(dòng)態(tài)分布Fig.2 Distribution of DHAV-3 in different tissues and organs

*. P<0.05; **. P<0.01圖3 感染后不同時(shí)間點(diǎn)肝中DHAV-3載量Fig.3 Viral load of DHAV-3 in the liver at different time points after infection

2.3.2 肝組織病理學(xué)變化 通過光學(xué)顯微鏡觀察DHAV-3感染雛鴨各時(shí)間點(diǎn)的肝病理組織學(xué)變化，結(jié)果顯示：感染1 h，局部肝組織毛細(xì)血管充血，肝細(xì)胞輕微腫脹(圖4A，箭頭所示)；感染3 h，肝細(xì)胞呈空泡變性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一的空泡(圖4b，箭頭所示)；感染6 h，肝細(xì)胞腫脹明顯，空泡變性加重，變性的肝細(xì)胞數(shù)目增多(圖4c，箭頭所示)；感染9 h，肝細(xì)胞呈嚴(yán)重空泡變性，肝組織呈網(wǎng)狀，細(xì)胞核懸于中央或被擠于一側(cè)(圖4 D和d，箭頭所示)；感染12 h，中央靜脈周圍肝細(xì)胞仍以空泡變性為主，并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖4e，箭頭所示)；感染24～48 h，肝中央靜脈及匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞大多呈壞死性變化，細(xì)胞核固縮消失，細(xì)胞質(zhì)碎裂呈碎片狀或消失形成空泡，周圍伴有大量易嗜性粒細(xì)胞浸潤(圖4f、g，箭頭所示)；感染72～96 h，匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞呈明顯增生性變化，周圍肝細(xì)胞多呈空泡性變化并伴有少量黃染的枯否細(xì)胞。對(duì)照組未觀察到病變。

2.4 肝細(xì)胞因子變化規(guī)律

染料法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)肝中干擾素及促炎性因子IL-1β、IL-2和IL-6各時(shí)間點(diǎn)含量變化，結(jié)果顯示，抗病毒細(xì)胞因子(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的DHAV-3感染后表達(dá)量逐漸升高，在感染48 h后達(dá)到峰值，上調(diào)倍數(shù)分別為30.60、27.31和19.15倍，72～96 h上調(diào)倍數(shù)下降。促炎因子(IL-1β、IL-2、IL-6)在感染前期(1～9 h)變化不明顯，感染12 h后顯著增高，24 h后達(dá)峰值，感染48～96 h逐漸下降。其中IL-1β峰值出現(xiàn)在感染后12 h，早于IL-2和IL-6(24 h)，但I(xiàn)L-2表達(dá)量上調(diào)最高，達(dá)1 448.25倍，高于IL-6和IL-1β的上調(diào)倍數(shù)分別為132.51和59.3倍(圖5)。

圖5 感染雛鴨肝細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Transcription level of cytokine mRNAs in liver of infected ducklings

3 討 論

3.1 DHAV-3人工感染7日齡雛鴨模型的意義

生產(chǎn)實(shí)踐中，往往使用疫苗免疫種鴨，通過母源抗體而使雛鴨獲得被動(dòng)的保護(hù)，但母源抗體在7日齡后常常下降到較低水平[28-29]，而使7日齡雛鴨感染DHAV后發(fā)病。雛鴨日齡對(duì)DHAV的致病性具有重要影響[23,30-31]，如蘇敬良等[3]報(bào)道DHAV-3(G株)感染2日齡雛鴨的死亡率為80%，感染7日齡雛鴨的死亡率為40%，而感染13日齡的雛鴨則不致死；本研究結(jié)果相似。DHAV-3 (QL株)在4日齡雛鴨上測(cè)得LD50=10-4.13·0.2 mL-1，而以2 000 LD50劑量的DHAV-3強(qiáng)毒感染7日齡雛鴨的致死率為40%(圖1)。目前針對(duì)DHAV-3的研究所建立的人工感染雛鴨病理模型很多，但主要集中在4日齡以內(nèi)[15-19]，因此，本研究建立DHAV-3人工感染7日齡雛鴨的疾病模型，測(cè)定病毒在其體內(nèi)分布規(guī)律、對(duì)肝組織病理學(xué)損傷、肝細(xì)胞因子含量變化等，分析病毒分布與病理損傷、抗病毒細(xì)胞因子、促炎性因子的關(guān)聯(lián)性，對(duì)進(jìn)一步闡明DHAV-3的致病機(jī)制具有重要意義。

3.2 DHAV-3在雛鴨體內(nèi)的分布規(guī)律

熒光定量結(jié)果顯示，DHAV-3在不同組織中病毒含量不同。DHAV-3感染1 h即可在所有組織器官中檢測(cè)到。這與林少莉等[18]和Q. X. Huang等[15]檢測(cè)結(jié)果相似，表明DHAV-3有廣泛的組織嗜性。但本研究中病毒全身性分布的時(shí)間要早。原因可能是攻毒劑量、毒株毒力不同等造成[18]。本研究中攻毒劑量為2 000 LD50(6×107.02copies·只-1)，攻毒1 h血液中病毒含量即達(dá)到105.04copies·mL-1。林少莉等攻毒劑量僅為20 ELD50，Q. X. Huang等攻毒劑量為4.73×104copies·只-1。本研究中DHAV-3在各組織中病毒含量隨感染時(shí)間逐漸升高，多數(shù)于24～48 h達(dá)峰值。這與DHAV的人工感染潛伏期一般為24 h結(jié)果一致。S. L. Lin等[14]檢測(cè)的200份臨床死亡雛鴨樣本中DHAV含量，結(jié)果表明DHAV-3感染死亡雛鴨的組織中，肝病毒含量最高(1010.42±0.71copies·g-1)，其次為脾和腎。這與本研究中結(jié)果相符，肝中病毒含量大于脾和腎，含量均在1010copies·g-1以上。林少莉等[18]和Q. X. Huang等[15]檢測(cè)結(jié)果表明DHAV-3感染的雛鴨肝中峰值時(shí)含量低于108copies·g-1，本研究中DHAV-3感染死亡的雛鴨肝中，病毒含量高于未死亡雛鴨峰值含量，平均含量為1011.47±0.37copies·g-1，更接近S. L. Lin等[14]檢測(cè)結(jié)果。研究表明初始感染劑量越高組織中病毒含量越高。推測(cè)臨床上雛鴨感染DHAV-3的劑量與本研究中攻毒劑量相近。張煥榮等[16]檢測(cè)DHAV-3感染雛鴨的組織病理學(xué)和病毒分布，發(fā)現(xiàn)腎也是病毒侵染的重要器官之一。筆者試驗(yàn)中，腎剖檢病變(未發(fā)表資料)和病毒含量都證明這一結(jié)論。但朱方偉等[19]建立免疫組化的方法檢測(cè)DHAV-3在雛鴨組織內(nèi)分布時(shí)，未在腎、心和腦中檢測(cè)到，這可能與檢測(cè)方法的敏感性有關(guān)。

3.3 DHAV-3致肝損傷與細(xì)胞因子變化的關(guān)聯(lián)

肝損傷是病毒與宿主之間相互作用的結(jié)果。先天免疫是機(jī)體第一道防線，病毒入侵后，首先被固有免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)上的模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素及白介素等細(xì)胞因子。干擾素能通過激活信號(hào)通路途徑誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄，在靶細(xì)胞內(nèi)建立抗病毒反應(yīng)體系或者通過激活效應(yīng)細(xì)胞和促進(jìn)獲得性免疫來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[32-33]。C．P. Song等[24]研究表明DHAV-1強(qiáng)毒和弱毒在雛鴨體內(nèi)可引發(fā)不同的先天免疫反應(yīng)，強(qiáng)弱毒均能誘導(dǎo)IFN表達(dá)量上調(diào)，強(qiáng)毒誘導(dǎo)IFN-γ更明顯，弱毒誘導(dǎo)IFN-α/β更強(qiáng)。本研究DHAV-3能夠誘導(dǎo)肝中Ⅰ型和Ⅱ型干擾素轉(zhuǎn)錄量上調(diào)，感染12 h后隨病毒含量逐漸升高，48 h達(dá)到峰值，其后病毒含量下降而誘導(dǎo)減弱。這與C. Q. Gu等[23]研究結(jié)果不同，DHAV-1強(qiáng)毒在感染12 h后，干擾素α表達(dá)量受到明顯抑制，僅在24 h出現(xiàn)短暫上調(diào)。這可能與雛鴨日齡或固有免疫水平有關(guān)。C．P. Song等[20]研究表明3周齡雛鴨擁有更強(qiáng)的先天免疫水平，細(xì)胞因子表達(dá)水平也較1日齡雛鴨更高。X. M. Ou等[33]研究結(jié)果也表明DHAV-1強(qiáng)弱毒在成年鴨上均能夠引起干擾素表達(dá)量明顯上調(diào)(1 000倍以上)。促炎因子可由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖、觸發(fā)急性期反應(yīng)和活化血管內(nèi)皮細(xì)胞等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而清除病毒和修復(fù)受損的組織[34]。本研究中IL-2/6在感染12 h明顯上調(diào)，并與肝病變嚴(yán)重程度呈正比。在感染24 h達(dá)到峰值，IL-2上調(diào)1 448倍，IL-6上調(diào)132倍，此時(shí)肝組織多呈壞死性變化，細(xì)胞核固縮消失，細(xì)胞質(zhì)碎裂呈碎片狀或消失形成空泡，周圍伴有大量易嗜性粒細(xì)胞浸潤。本研究中IL-1β峰值時(shí)間要在感染后12 h，早于其他細(xì)胞因子，這提示IL-1β可能在炎癥反應(yīng)早期發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

以DHAV-3強(qiáng)毒感染7日齡雛鴨，發(fā)現(xiàn)DHAV-3在雛鴨體內(nèi)具有廣泛的組織嗜性，肝、脾、腎是病毒攻擊的主要靶器官，肝中細(xì)胞因子可能在抑制病毒增殖和修復(fù)組織損傷過程中發(fā)揮重要作用。

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