樹脂對楸靈素吸附與洗脫特性的影響

馮婷婷, 苗辰飛, 于湘莉, 苗志奇

(上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海 200240)

目前, 癌癥已嚴(yán)重威脅人類的健康和社會發(fā)展[1-2], 因此尋求高效的抗癌藥已引起人們廣泛關(guān)注[3]. 但天然抗癌藥均存在資源緊缺和價格高昂等問題, 如紫杉醇[4-6]、 長春新堿[7-8]和鬼臼毒素[9-10]等. 楸靈素為楸樹的植物內(nèi)生真菌FSN002培養(yǎng)時分泌的一種黃酮類物質(zhì), 分子量為498, 分子結(jié)構(gòu)中有1個親水端和1個疏水端, 是一種具有表面活性劑性質(zhì)的物質(zhì), 其水溶性較好且呈弱酸性, 在中性或弱堿性條件下能保持穩(wěn)定. 含楸靈素的發(fā)酵液對肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇抑制效果[11], 且發(fā)酵液中楸靈素的濃度與抑制癌細(xì)胞的能力成正比, 說明楸靈素是發(fā)酵液中的主要抗癌物質(zhì)[12]. 楸靈素的分離純化可減少發(fā)酵液所含雜質(zhì)引起的毒副作用, 但目前僅采用冷凍濃縮[13]及萃取反萃[14]法濃縮分離楸靈素, 收率與成本均較高, 且萃取及反萃所需有機(jī)溶劑用量較大, 具有一定毒性, 環(huán)保性差. 大孔樹脂的物理、 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定, 對酸堿不敏感, 選擇性能好[15], 因此常用作植物內(nèi)生真菌中有效成分的分離和富集, 且成效明顯[16-17]. 目前尚未見大孔樹脂應(yīng)用于楸靈素分離純化的研究報道. 本文研究大孔樹脂對楸靈素吸附與洗脫特性以及吸附動力學(xué)過程, 為楸靈素在粗提取工藝中樹脂的選取提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌 株

楸樹內(nèi)生真菌FSN002由上海交通大學(xué)植物生物技術(shù)中心分離并保存[18].

1.2 楸靈素發(fā)酵液制備

采用馬玲薯葡萄糖瓊脂(PDA)液體培養(yǎng)基[18]. 取-80 ℃保存的真菌孢子, 以106個/L的接種量接種到含100 mL PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中. 于25 ℃ 100 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)7 d, 發(fā)酵液變?yōu)榱咙S色, 過濾去除菌絲, 收集發(fā)酵液于4 ℃冰箱保存[13].

1.3 儀 器

主要實驗儀器有： 微量移液器(德國Eppendorf公司); 電熱恒溫干燥箱(DHG-9240A型, 上海精宏實驗設(shè)備有限公司); 恒溫?fù)u床(DHZ-DA型, 江蘇太倉實驗設(shè)備廠); 超純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司); 臺式高速離心機(jī)(5417R型, 德國Eppendorf公司); 高壓蒸汽滅菌鍋(SS-325型, 日本TOMY公司); 數(shù)顯pH計(pHS-3TC型, 上海天達(dá)儀器有限公司); 高效液相色譜儀(2996型, 美國Waters公司).

1.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附和洗脫實驗

將反相樹脂AB-8,NKA-2,NKA-9,HP-20,HPD-200L,HPD-300L,HPD-400,HPD-400A及離子型樹脂D330,D318,D201,D311活化預(yù)處理后, 用去離子水洗凈后備用. 將1 mL樹脂置于50 mL三角錐形瓶中, 加入pH=7.0的含楸靈素發(fā)酵液10 mL, 恒溫20 ℃, 搖床上100 r/min振蕩1 h后, 將余液除去, 用去離子水洗凈. 反相樹脂采用10 mL純甲醇洗脫10 min, 離子樹脂采用體積分?jǐn)?shù)為95%的甲醇飽和氯化鈉溶液10 mL洗脫10 min, 并分別取樣. 所有樣品均采用高效液相色譜(HPLC)方法檢測楸靈素的質(zhì)量濃度(用C18反相色譜柱, 甲醇、 水作為流動相梯度洗脫, 于286 nm紫外檢測進(jìn)行定量分析)[18]. 每組進(jìn)行3次重復(fù)實驗. 質(zhì)量濃度

ρt=(At/A標(biāo)準(zhǔn)品)×ρ標(biāo)準(zhǔn)品,

(1)

其中：ρt為某時刻樣品的質(zhì)量濃度(mg/mL);At為某時刻樣品的峰面積;A標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積;ρ標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(mg/mL).

吸附量=(ρ0-ρt)×Va/V樹脂,

(2)

其中：ρ0為發(fā)酵液樣品的初始質(zhì)量濃度(mg/mL);Va為發(fā)酵液樣品的溶液體積(mL);V樹脂為大孔樹脂的體積(mL).

洗脫量=ρJ×Vb/V樹脂, 洗脫收率=洗脫量/吸附量,

(3)

其中：ρJ為樣品從樹脂洗脫下楸靈素的質(zhì)量濃度(mg/mL);Vb為洗脫液的體積(mL). 分離總收率為吸附收率和洗脫收率的乘積. 分離純度為洗脫樣品中楸靈素色譜峰面積占總面積的百分?jǐn)?shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附實驗結(jié)果

選擇性質(zhì)不同的大孔樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附實驗, 不同大孔樹脂的吸附曲線如圖1所示. 由圖1可見, 大孔樹脂上的楸靈素靜態(tài)吸附曲線呈典型飽和曲線特征： 在吸附初期, 隨著吸附時間的延長, 吸附量迅速增長, 為線性吸附期; 在吸附后期, 楸靈素吸附量達(dá)到平衡, 吸附曲線進(jìn)入平臺期. 所有反相樹脂達(dá)到平衡時的楸靈素吸附量均約為40 mg/mL(圖1(A),(B),(C)), 吸附余液中楸靈素幾乎完全消失, 離子型大孔樹脂達(dá)到平衡時的楸靈素吸附量均約為28 mg/mL(圖1(D)), 即12種大孔樹脂均可有效吸附發(fā)酵液中的楸靈素. 其中HP-20具有最大的吸附速率, 僅需約20 min即可達(dá)到吸附平衡; NKA-9及D系列離子型樹脂約需60 min達(dá)到楸靈素吸附平衡; 其他大孔反相樹脂達(dá)到吸附平衡的時間均約為30 min.

圖1 不同大孔樹脂的吸附曲線Fig.1 Adsorption curves of different macroporous resins

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附模型

為消除實驗誤差的影響, 定量研究大孔樹脂對楸靈素的靜態(tài)吸附性能, 建立楸靈素靜態(tài)吸附動力學(xué)模型. 一級Lagergren方程是進(jìn)行固液體系模擬分析的常用模型[19], 假設(shè)楸靈素吸附過程符合該模型, 即

dQ/dt=k(Qe-Q),

(4)

其中：Q為t(min)時刻單位樹脂吸附量(mg/mL);Qe為最大吸附能力, 即吸附達(dá)到平衡時單位樹脂吸附量(mg/mL);k為吸附速率常數(shù)(min-1). 設(shè)邊界條件：t=0,Q=0;t=∞,Q=Qe. 將吸附速率方程按邊界條件積分, 可得：

lnQe-ln(Qe-Q)=kt,

(5)

1-Q/Qe=e-kt.

(6)

假設(shè)吸附過程楸靈素?zé)o損失, 則根據(jù)質(zhì)量守恒定律可得：

QeVM+VLρe=VLρ0,

(7)

QVM+VLρ=VLρ0,

(8)

其中：ρ0為發(fā)酵液中楸靈素的初始質(zhì)量濃度(mg/mL);ρe為吸附平衡后發(fā)酵液中楸靈素的質(zhì)量濃度(mg/mL);ρ為吸附過程任意時刻發(fā)酵液中楸靈素的質(zhì)量濃度(mg/mL);VL為發(fā)酵液的體積(mL);VM為濕樹脂的體積(mL);k為吸附速率常數(shù).

由式(6)～(8)可得

ρ/ρ0=ρe/ρ0+(1-ρe/ρ0)e-kt.

(9)

將1-ρe/ρ0用A=VMρe/(VLρ0)表示, 可得：

ρ=(1-A)+Ae-kt,

(10)

K=A/(1-A),

(11)

其中K為吸附平衡常數(shù). 由式(9)可知, 在靜態(tài)吸附過程中, 發(fā)酵液中楸靈素的相對質(zhì)量濃度隨吸附時間呈指數(shù)遞減. 利用動態(tài)規(guī)劃方法, 借助靜態(tài)吸附實驗中楸靈素相對質(zhì)量濃度的動力學(xué)數(shù)據(jù)擬合模型參數(shù), 獲得各樹脂的吸附速率常數(shù)及最大吸附量, 結(jié)果列于表1. 由表1可見: 楸靈素模擬動態(tài)吸附量與實測吸附量相符, 平均誤差小于0.01, 表明該模型可準(zhǔn)確描述樹脂對楸靈素的吸附過程; 楸靈素的吸附符合一級動力學(xué)過程； 12種樹脂的平均吸附速率常數(shù)為0.10 min-1; 實驗所用反相樹脂與離子交換樹脂的平均吸附速率常數(shù)差別較??； NKA-9的吸附速率常數(shù)最低, HP-20的吸附速率常數(shù)最高; 所有反相類型樹脂的最大吸附能力均大于39.39 mg/mL, 離子型樹脂平均約為28.54 mg/mL, 即類型相同大孔樹脂的最大吸附能力基本相同, 反相樹脂的吸附能力更佳.

表1 大孔樹脂對楸靈素吸附和洗脫特性的影響

2.3 大孔樹脂靜態(tài)洗脫實驗結(jié)果

a. AB-8; b. NKA-9; c. NKA-2; d. HP-20;e. HPD-300L; f. HPD-200L; g. HPD-400;h. HPD-400A; i. D318; j. D311; k. D330; l. D201.圖2 大孔樹脂的洗脫收率Fig.2 Elution rates of macroporous resins

將吸附楸靈素達(dá)到平衡后的樹脂進(jìn)行洗脫, 分析洗脫液中楸靈素的質(zhì)量濃度, 計算各樹脂的洗脫收率, 結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見, 洗脫收率中反相樹脂僅NKA-2較高, 為57%, 其他反相樹脂均約為5%～6.5%. 離子型大孔樹脂的洗脫收率平均為46.6%, 即離子型樹脂比反相樹脂更易洗脫楸靈素, D201樹脂的洗脫能力最強(qiáng).

2.4 大孔樹脂綜合評定與分析

樹脂性能的優(yōu)劣主要取決于楸靈素從樹脂上洗脫的收率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 樹脂的吸附快慢及吸附單位楸靈素所用樹脂量. 由表1可見, 大孔反相樹脂略優(yōu)于離子樹脂的吸附性能, 但楸靈素的收率較少, 除NKA-2外洗脫性能均較差. 離子型樹脂的吸附速率常數(shù)較低, 但洗脫率較高, 楸靈素的收率高, 尤其是D201的收率最高， 且樹脂的價格低, 因此D201是優(yōu)選樹脂.

在反相樹脂中, HP-20,HPD-400,HPD-400A的吸附速率常數(shù)較高, 并可快速達(dá)到平衡, 主要是因為被分離物質(zhì)及樹脂的極性所致[20], 極性大小一般由分子中TAI基、 糖基等極性基團(tuán)與烷基和苯環(huán)等非極性基團(tuán)的數(shù)量及大小確定[21]. 楸靈素是一種極性較小, 且分子量小的化合物, 極性小的樹脂如HP-20和HPD系列等均易與其形成牢固的氫鍵, 而極性大的樹脂則不易形成氫鍵, 由于大孔樹脂均具有良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的比表面積, 因此通過物理吸附作用力可從發(fā)酵液中選擇性吸附楸靈素, 一段時間后可將楸靈素完全吸附, 吸附率為100%. 在洗脫過程中, 除NKA-2外, 其他大孔反相樹脂的洗脫收率均較低, 僅為6%. 由于極性較小的大孔樹脂對楸靈素的其的吸附能力較強(qiáng), 因此不易洗脫[22]. 大孔樹脂NKA-2與NKA-9極性相似, 但NKA-2優(yōu)于NKA-9的洗脫性能, 這是由于受樹脂的孔徑、 比表面積和孔容等空間結(jié)構(gòu)的影響所致[23].

離子型大孔樹脂的吸附速率常數(shù)中最大為D330, 其次為D201,D318,D311. 這主要由其活性功能基團(tuán)決定; D330為環(huán)氧結(jié)構(gòu)樹脂, 功能基團(tuán)多, 可吸附分子和離子形式; D201樹脂含有叔胺基團(tuán), 主要與離子形式存在的楸靈素結(jié)合; D311及D318樹脂呈弱堿性, 主要與分子形式的楸靈素結(jié)合. 4種樹脂的吸附率較高, 但均為不完全吸附, 這是由于樹脂上可能存在反相吸附位點而導(dǎo)致死吸附. 采用鹽和甲醇配比溶液洗脫, 其中甲醇反相洗脫樹脂核心, 鹽洗脫離子. D201的洗脫收率最高, 其次為D330,D318,D311. 反相樹脂高于離子樹脂的吸附能力, 但其洗脫能力相對較差, 這是由于楸靈素具有表面活性所致, 其水溶性較好, 具有疏水性和親水性, 水環(huán)境中楸靈素在強(qiáng)疏水性樹脂表面形成單分子膜, 疏水頭部通過疏水相互作用牢固吸附在強(qiáng)疏水樹脂表面上, 親水尾部排列在外形成親水表面. 在實現(xiàn)強(qiáng)吸附的過程中, 楸靈素將樹脂微環(huán)境從疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性, 不利于親脂性溶劑的接近, 導(dǎo)致楸靈素不易洗脫. 中等極性的反相樹脂不能形成完整的單分子膜, 最大吸附能力下降, 但洗脫變得相對容易. 離子交換樹脂吸附包括離子交換吸附及樹脂基質(zhì)反相吸附, 通過離子交換吸附的楸靈素在飽和鹽甲醇溶液中可實現(xiàn)完全洗脫, 因此洗脫收率較高.

綜上, 本文可得如下結(jié)論: 1) 12種大孔樹脂可有效吸附發(fā)酵液中的楸靈素, 靜態(tài)吸附曲線呈典型飽和曲線特征, 其中反相樹脂高于離子型樹脂的吸附量及吸附速率; 2) 樹脂吸附楸靈素的過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型, 擬合度較高; 3) 離子型樹脂吸附的楸靈素易洗脫, 其中D201樹脂的洗脫收率最高, 為83%; 4) 考慮12種樹脂的吸附及洗脫性能, D201樹脂的綜合性能最好.

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