微波輔助法提取紫蘇油粕黃酮工藝及其抗氧化性的研究

張 艷，張傳智，徐 淼，田海娟

(吉林工商學院 糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林 長春 130507)

紫蘇籽系唇形科一年生草本植物紫蘇的成熟果實，含有豐富的脂肪和蛋白質，其中油脂含量為40%～50%，蛋白質含量約為25%[1]，另外還含有黃酮、多酚、迷迭香酸、兒茶素等多種抗氧化成分，對消除自由基、防止脂質過氧化、阻斷亞硝基類物質具有一定的作用，對于保健、防衰老有獨特的意義[2]。目前，對紫蘇抗氧化成分提取的相關研究很多，但大多都集中在從其根、莖、葉中提取[3～6]，從紫蘇籽中提取則鮮有報道。紫蘇油粕是紫蘇籽脫脂后的副產(chǎn)品，主要被當作動物飼料、燃料或回收入田充當肥料，紫蘇油粕中豐富的抗氧化成分沒有得到合理的利用，造成了資源的浪費[7]。

微波輔助提取法(簡稱微波法)是在傳統(tǒng)溶劑萃取的基礎上發(fā)展起來可以有效提高萃取率的輔助技術，是利用高頻電磁波穿透萃取介質，到達物料的內(nèi)部維管束和腺胞系統(tǒng)，使細胞破裂，從而使細胞內(nèi)有效成分自由流出；同時微波產(chǎn)生的電磁場還可加速被萃取成分向萃取溶劑界面擴散，使有效成分在相對較低的溫度下以較快的速度被萃取，從而最大限度保證萃取的質量[8]。具有快速、高效、加熱均勻，節(jié)省能源的特點[9]。其操作方便，提取率高，是近幾年來出現(xiàn)在功能成分提取方面的新技術之一。本研究采用微波輔助法提取紫蘇油粕中抗氧化成分—黃酮，優(yōu)化工藝參數(shù)，與傳統(tǒng)的提取方法進行對比分析；并在完成紫蘇油粕黃酮微波提取方法的基礎上研究紫蘇油粕黃酮的抗氧化性，從而為紫蘇油粕抗氧化性功能的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇油粕：吉林省洮南市百群食品科技有限公司提供。鄰二氮菲、硫酸亞鐵、冰乙酸、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為分析純，購于北京藍弋化學試劑有限公司。蘆丁標準品：上海永葉生物科技有限公司。

WGD2S-01微波發(fā)生器：南京三樂微波技術發(fā)展有限公司；L5S紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器廠；20B萬能粉碎機：江陰市普友粉體設備有限公司；PHS-3C pH計：上海儀器設備有限公司；MS-H-Prot恒溫磁力攪拌器：上海大龍電器有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機：北京安亭科學儀器廠；LGJ-10冷凍干燥機：北京松原華興科技發(fā)展有限公司；AL204電子天平：瑞士梅特勒公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制：精密稱取蘆丁標準品0.025 g，置于100 mL容量瓶，加80%的乙醇搖勻使之溶解，定容。精密吸取蘆丁溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于50 mL容量瓶中，加質量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉1.5 mL，搖勻后放置6 min，再加質量分數(shù)為10%的硝酸鋁1.5 mL搖勻，放置6 min；加質量分數(shù)為10%的氫氧化鈉溶液20 mL，再加80%的乙醇定容，混勻，放置15 min。以80%的乙醇作為空白對照,在510 nm下測其吸光度3次，取平均值，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，繪制標準曲線(見圖1)，建立回歸方程[10]。

根據(jù)圖1所示，可得回歸方程：y=12.897x+0.003 1，相關系數(shù)R2=0.999。表明在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)蘆丁濃度與吸光度值有良好的線性關系，能夠進行黃酮類物質的測定。

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.2 紫蘇油粕黃酮得率的計算：采用亞硝酸鈉—硝酸鋁顯色法測定紫蘇油粕黃酮的得率。公式：

式中:C為根據(jù)蘆丁標準曲線計算出的提取液中黃酮的濃度(g/mL)，V為樣品提取液總體積(mL)，M為樣品質量(g)。

1.2.3 微波法提取紫蘇油粕黃酮工藝流程：紫蘇油粕→粉碎→加入乙醇→微波處理→冷卻振蕩→離心分離→上清液→過濾→濃縮干燥→抗氧化物質。

1.2.4 單因素實驗：精確稱取一定量的脫脂紫蘇油粕粉末，加入乙醇溶液后，進行微波處理，冷卻振蕩10 min，再提取紫蘇油粕黃酮。根據(jù)1.2.2的公式，計算紫蘇油粕中黃酮的得率。以黃酮得率為評價指標，對料液比(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL)、乙醇濃度(15%、30%、45%、60%、75%、90%)、微波功率(100、200、300、400、500、600 W)、微波時間(15、30、45、60、75、90 s)4個因素分別進行單因素試驗，以確定固液比、乙醇濃度、微波功率、微波時間對黃酮得率的影響。

1.2.5 微波提取工藝參數(shù)的優(yōu)化：在單因素試驗的基礎上，選取4因素的3水平進行L9(34)正交試驗，并進行方差分析和試驗驗證，從而確定微波法提取紫蘇油粕黃酮的最佳工藝參數(shù)。

1.2.6 微波法與傳統(tǒng)提取法的對比：傳統(tǒng)提取法為：準確稱取紫蘇油粕干粉末3份，分別放入三角瓶中，按1:20的比例與60%的乙醇溶液進行料液配比，將其放入80 ℃的水浴鍋中回流提取2 h，將提取液進行真空抽濾至小于100 mL，將濾液定容至100 mL后在510 nm下測其吸光度[11]，根據(jù)1.2.2計算紫蘇油粕黃酮得率，與微波法進行對比分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理及作圖，SPSS軟件進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對紫蘇油粕黃酮得率(以下簡稱得率)的影響

把脫脂后的紫蘇油粕按1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL的比例與濃度為50%乙醇溶液進行配比，在300 W、50 s的條件下進行微波處理，得率結果見圖2。

由圖2可知，隨著料液比的增大，黃酮得率逐漸上升，當料液比達到1:20后，增幅變緩。這由于在料液比低的情況下，溶劑量少，導致黃酮類物質溶出少，隨著萃取劑的增加，物質充分、快速溶解流出，當料液比達到1:20時，得率隨著料液比的變大增幅又變小，也就是說，料液比在1:20左右時，萃取劑已經(jīng)很充足。因此在1:15至1:25的料液比范圍內(nèi)提取效果較好，1:20時最佳。

圖2 料液比對得率的影響

2.1.2 乙醇濃度對得率的影響

用濃度分別為15%、30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液按1:10的料液比進行配比，在300 W、50 s的條件下微波處理，得率結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對得率的影響

由圖3可知，隨著乙醇濃度的升高，黃酮得率逐漸增大，當濃度達到60%左右，達到最高值，再隨著濃度的增加，得率反而略有下降，這是由于乙醇濃度過高可能導致紫蘇油粕中的黃酮類物質被破壞，從而使得率下降。結合成本考慮，乙醇的濃度范圍選擇在30%～60%較為合適。

2.1.3 微波功率對得率的影響

按料液比1:10 g/mL，把脫脂后的紫蘇油粕物料與濃度為50%的乙醇溶液進行配比，分別在功率為100、200、300、400、500、600 W的條件下微波處理50 s，冷卻后再恒溫振蕩10 min，計算得率結果見圖4。

由圖4可知，由于微波這種高頻電磁波穿透萃取介質，到達物料的內(nèi)部，使細胞破裂，且溫度升高，細胞內(nèi)有效成分自由流出。當600 W左右時，則溫度過高，導致部分抗氧化物質降解，從而使黃酮得率略有下降。因此選擇微波功率范圍在300～500 W較為合適。

圖4 微波功率對得率的影響

2.1.4 微波時間對得率的影響

在同上的條件下，微波功率為300 W時，分別微波15、30、45、60、75、90 s，冷卻振蕩10 min后，提取紫蘇油粕黃酮，結果見圖5。

圖5 微波時間對得率的影響

由圖5可知，黃酮的得率隨著時間的延長而逐漸增大，60 s后，提取率略有下降。這是由于隨著微波時間的延長，提取溫度快速升高，萃取劑及物料都變得不穩(wěn)定，從而使得率下降。因此選擇微波的時間為45～75 s較為合適。

2.2 正交試驗優(yōu)化提取工藝條件

在2.1單因素試驗結果的基礎上，選取4因素的3水平進行L9(34)正交試驗(見表1和2)，并進行方差分析和試驗驗證(見表3)，從而確定微波法提取紫蘇油粕黃酮的最佳工藝參數(shù)。

表1 正交試驗因素水平

表2 紫蘇油粕黃酮提取工藝正交試驗結果

表3 方差分析

由表2、3可知，影響紫蘇油粕抗氧化物提取率的因素由大到小依次是：D>C>B>A，即微波時間>微波功率>乙醇濃度>料液比，且微波的時間、功率具有顯著的影響(α=0.05)。以黃酮得率為評價指標，最佳工藝條件為：A2B3C3D2，即料液比為1:20，乙醇濃度為60%，微波功率為500 W，微波時間60 s。在上述最佳條件下進行驗證實驗，經(jīng)過3次實驗，平均提取率為3.04%。

2.3 微波提取法與傳統(tǒng)提取法的對比分析

根據(jù)1.2.6，用傳統(tǒng)方法提取紫蘇油粕中的黃酮，結果顯示提取率為1.97%，而微波提取法可得到的最佳提取率為3.04%。比較兩者，微波法較傳統(tǒng)方法提高提取率54.31%。在相同乙醇濃度時，微波法比傳統(tǒng)提取法乙醇溶液用量少；在提取時間方面，傳統(tǒng)法需30 min的提取時間，微波法11 min即能達到理想的提取效果。結果見表4。由此可知：以黃酮得率為判斷標準，使用微波提取法提取紫蘇油粕抗氧化物質優(yōu)于傳統(tǒng)的提取方法。

表4 2種提取紫蘇黃酮方法的比較

2.4 抗氧化性的測定

2.4.1 清除羥自由基的能力

羥基自由基是活性氧中最活潑的氧自由基之一，它幾乎能與活細胞中任何分子發(fā)生反應，引發(fā)組織細胞病變，導致各種疾病發(fā)生和加速機體衰老。減少此類自由基可預防衰老、心血管疾病，并具有防癌抗癌的作用。如圖6所示，提取的紫蘇油粕抗氧化物濃度與羥自由基的清除能力呈量效關系，當濃度達0.3 mg/mL時，清除率可達75%。在0.05～0.3 mg/mL范圍內(nèi)與Vc相比較，清除自由基能力略低但接近于Vc。由此可知紫蘇油粕抗氧化物對羥自由基有一定的清除能力。

圖6 清除羥基自由基的能力

2.4.2 清除超氧陰離子自由基的能力

如圖7所示，在所測定濃度范圍內(nèi)，紫蘇油粕抗氧化物對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，并且隨濃度的增加呈增大的趨勢，但清除能力低于Vc，其活性相對較弱。在濃度0.3 mg/mL時其清除率己經(jīng)達到77%。

圖7 清除超氧陰離子自由基的能力

3 結論

微波輔助法提取紫蘇油粕黃酮的最佳工藝條件為用濃度60%乙醇，按1:20 g/mL的比例進行料液配比，經(jīng)過60 s、500 W微波處理，得率達到3.04%，與傳統(tǒng)的提取方法相對比，其黃酮得率提高54.31%。紫蘇油粕黃酮對羥基、超氧陰離子自由基具有一定的清除能力。在0.05～0.3 mg/mL的范圍內(nèi)，其清除能力與抗氧化物的濃度呈良好的量效關系。與Vc相比較，清除羥基自由基能力接近于Vc；清除超氧陰離子自由基的能力則低于Vc。在濃度為0.3 mg/mL時，對兩種自由基的清除率分別可達75%、77%。

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