黃精不同炮制品抗疲勞及抗氧化作用比較研究

★ 楊華杰 龔千鋒 于歡 鐘凌云 張金蓮 王文凱（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004）

黃精作為一味補(bǔ)益類(lèi)中藥材，其性甘、平，質(zhì)滋潤(rùn)，歸腎、脾、肺經(jīng)，有補(bǔ)脾益氣、滋腎滋潤(rùn)肺部的藥效，用于治療燥咳、腎精虧虛、腰膝酸軟等證［1］。現(xiàn)代藥理證明，它有降血糖［2］、抗疲勞［3］、提高免疫［4］等藥理作用。肌肉疲勞是機(jī)體最為常見(jiàn)的現(xiàn)象，但也是一個(gè)較為復(fù)雜的現(xiàn)象。當(dāng)機(jī)體不能維持一定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度或水平時(shí)，就是肌肉已經(jīng)疲勞了，其表現(xiàn)形式大多為力竭，機(jī)體維持一定運(yùn)動(dòng)狀態(tài)直至力竭，這是一種病理狀態(tài)［5］。

機(jī)體在維持日常機(jī)能情況下，無(wú)時(shí)不刻不在被氧化著，伴隨著氧化的過(guò)程，會(huì)有大量的自由基產(chǎn)生，在正常的生理?xiàng)l件下，機(jī)體可以通過(guò)自身的抗氧化系統(tǒng)維持一個(gè)相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡。但當(dāng)隨著氧化過(guò)程產(chǎn)生的自由基不能夠被及時(shí)清除時(shí)，其會(huì)與體內(nèi)的其他大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，損壞其正常的生理功能，從而導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，例如心血管疾病和衰老等［6］。體內(nèi)自由基的清除有賴(lài)于SOD等的酶的活性，MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)品，能夠反應(yīng)細(xì)胞受自由基攻擊而導(dǎo)致毀傷的水平。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃精抗疲勞以及抗氧化的藥效作用的研究，比較黃精不同炮制品的藥效作用，為建昌幫特色炮制飲片炆制黃精的機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 黃精不同炮制品的制備

1.1.1 黃精飲片的制備 取黃精藥材，進(jìn)行分檔并除去泥沙雜質(zhì)及蟲(chóng)蛀霉變品，清洗干凈泥沙，用濕紗布略潤(rùn)，切厚片（2～4mm），曬干，篩去灰屑，備用。

1.1.2 藥典法酒黃精飲片的制備［7］取凈選好的黃精，加黃酒攪拌均勻，每100kg黃精，用黃酒20kg。放到蒸制的器具內(nèi)，蒸透，或密閉隔水燉至黃酒全部被吸盡，表面色澤黑潤(rùn)，口嘗沒(méi)有麻舌感時(shí)，用手拿出來(lái)，置于搪瓷盤(pán)內(nèi)，稍晾，切厚片，曬干。

1.1.3 建昌幫炆制黃精飲片的制備［8］取原藥材，進(jìn)行分檔并除去泥沙雜質(zhì)及蟲(chóng)蛀霉變品，清晰干凈，用流水漂約1d，取出，瀝干水，轉(zhuǎn)移至炆藥罐內(nèi)，每各炆藥罐放藥至2/3處，注入溫度適中的蒸餾水，上蓋，轉(zhuǎn)移到圍灶內(nèi)，炆藥罐之間放幾塊木炭（起到助燃的作用），并鋪滿(mǎn)足夠的谷糠，點(diǎn)著后，炆24h，直到藥用筷子扎可以扎透，汁被吸盡。用手將藥從罐中掏出來(lái)，曬干，用酒將藥材撒一層，每100kg黃精，用黃酒30kg，悶潤(rùn)，待黃酒吸盡后，用木甑蒸至“圓汽”后約4 h，燜一夜，直到藥材轉(zhuǎn)成黑漆色時(shí)，用手拿出來(lái)，曬干至半干，切斜厚片，70℃烘干。

1.1.4 九蒸九曬黃精飲片的制備 取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，將適量（約10%用量）黃酒與凈選好的生品黃精攪拌均勻，并悶潤(rùn)至黃酒被藥材吸盡（每100kg黃精，用黃酒20kg）。第一次蒸制、曬干：要求第一次“蒸至黃精中央發(fā)虛為度”（蒸制操作時(shí)，要把蒸制過(guò)程中流出的汁液進(jìn)行收集），用手拿出來(lái)，“放在太陽(yáng)下曬至藥材外皮微干”，之后將上一步的成品拌入收集的汁液和一定量的黃酒，并“悶潤(rùn)至輔料被藥材吸盡”。反復(fù)蒸制、曬干：按第1回蒸制、干燥方法，再蒸，再放到太陽(yáng)底下曬至藥材表面微干，再拌入上一步收集的汁液，一定量的黃酒，依照此方法連續(xù)操作，蒸制曬八次。第2次至第8次蒸制所需酒的量為總體的70%。第九次蒸制、曬干：將其余（20%）酒及收集的汁液拌入藥材中，蒸至表面黑漆色，表面發(fā)亮。

1.2 黃精不同炮制品水煎液的制備 分別取黃精生品、炆制品、酒制品、九蒸九曬品飲片各100g，加入10倍量蒸餾水浸泡1h后加熱，微沸后持續(xù)加熱0.5h，濾過(guò)后剩余的藥物殘?jiān)偌尤?倍量蒸餾水持續(xù)加熱0.5 h，用4層醫(yī)用紗布濾過(guò)后將兩次的濾液放到一起，水浴濃縮至200 mL，即藥液約為0.5 g/mL，放入4℃冷藏柜。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)KM種雄性小白鼠，體質(zhì)量18～22g，購(gòu)于山東魯機(jī)醫(yī)藥股份有限公司（合格證號(hào)：SCXK魯20130001）。

1.4 試藥 肝糖原試劑盒（南京建成生物工程研究所）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒（批號(hào)：20161002，南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：2016100，南京建成生物工程研究所）；哇哈哈純凈水；濃硫酸（批號(hào)：20150713，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸（批號(hào)：1508191，西隴化工股份有限公司）；生理鹽水。黃精藥材產(chǎn)地江西，批號(hào)1509002，購(gòu)自江西樟樹(shù)天齊堂公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院葛菲教授鑒定為黃精的干燥根莖。

1.5 儀器 UV 8000S型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司）；SQP型萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；安穩(wěn)血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；JR-3021HR高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；-80℃冰箱（LABWAY SCIENCE，德國(guó)）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與處理

2.1.1 動(dòng)物分組、空腹血糖（FBG）值以及肝糖原 取KM種小鼠50只，在動(dòng)物房自然飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為5組，即生品組、炆黃精組、酒黃精組、九蒸九曬組以及空白對(duì)照組，10只一組，不給鼠糧但飲水自由喂養(yǎng)8h后，眼內(nèi)眥靜脈取血，電子血糖儀法測(cè)FBG，從2d起，以10g/kg黃精各炮制品提取液每日灌胃給藥1次，每次，空白對(duì)照組予以等容積的0.9% NaCl，連續(xù)給藥30d。第29d禁食不禁水8h后，眼內(nèi)眥靜脈取血，電子血糖儀法測(cè)定FBG，觀察黃精各炮制品對(duì)自然狀態(tài)下生長(zhǎng)的小鼠血糖的影響。末次灌胃給藥結(jié)束0.5h后，處死動(dòng)物取出肝臟。按試劑盒檢測(cè)肝糖原。

2.1.2 負(fù)重游泳力竭時(shí)間［3］另50只取KM種小鼠，在動(dòng)物房自然飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組、生品組、炆黃精組、酒黃精組、九蒸九曬組，一組10只，分別進(jìn)行灌胃，每次每只給藥10g/kg，空白對(duì)照組予以等體積的0.9% NaCl，連續(xù)灌胃15d，末次灌胃完成0.5h后，在尾巴根處1cm加一相對(duì)其體重5.5%的鐵絲，使其在深度為50cm、溫度為（25.5±0.5）℃的水箱中自由活動(dòng)至力竭，并計(jì)時(shí)。力竭耗時(shí)為放到水中開(kāi)始計(jì)時(shí)到其沉下去再也不浮起來(lái)5s的間隔。

2.1.3 SOD及MDA的測(cè)定 另取50只雄性KM種小鼠（18～22g），適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將其分成5組，分別為空白對(duì)照組、生品組、炆制品組、酒制品組、九蒸九曬品組，給藥組均予以10g/kg相應(yīng)的黃精炮制品提取液，空白對(duì)照組予以0.9% NaCl，灌胃給藥，給藥15d，末次給藥結(jié)束后0.5h，使其在深度為50cm，溫度（25.5±0.5）℃的水箱中進(jìn)行無(wú)負(fù)重自由活動(dòng)90 min，休息1 h后摘眼球取血。將所取血液靜置1h后，于4℃下、4000r/min 操作10min，用移液槍將上層的清澈液體吸走，并進(jìn)行分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩⒄赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD、MDA指標(biāo)。

2.2 小鼠一般狀態(tài)和大體病理觀察 在灌胃給藥這段時(shí)間里，觀察生品組、炆制品組、酒制品組以及九蒸九曬品組小鼠的生理以及精神狀態(tài)。并且，在最后要把每只進(jìn)行解剖，查看實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的內(nèi)臟是否有病理性的變化。

3 結(jié)果

3.1 空腹血糖值的比較 結(jié)果顯示：藥典法的酒黃精組和傳統(tǒng)炮制方法的九蒸九曬品組給藥前后與自身對(duì)照，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），生品組給藥前后與自身對(duì)照，其差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且P＜0.01，建昌幫特色制備方法炆制品組與給藥前自身比較血糖值有一定的升高，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與給藥后的空白對(duì)照組比較，生品組的血糖值具有顯著性差異，其余各組血糖值雖有所升高，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：黃精生品、酒制品以及九蒸九曬品在給藥后會(huì)引起小鼠的血糖升高，生品組引起的血糖升高尤為顯著。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)正常小鼠空腹血糖的影響（，n=10）

表1 對(duì)正常小鼠空腹血糖的影響（，n=10）

注：給藥前后與自身比較，*P＜0.05，**P＜0.01；給藥后與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

空白對(duì)照組 - 4.68±0.71 5.27±0.63生品 10 4.35±0.59 5.76±0.33**#炆制品 10 4.63±0.58 5.16±0.48酒制品 10 4.52±0.28 5.38±0.68*九蒸九曬品 10 4.34±0.77 5.35±0.59*

3.2 肝糖原含量的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃精炮制品對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝糖原影響與空白對(duì)照組相比，酒制品與九蒸九曬品組有明顯的提升（P＜0.05），生品組和炆制品組的肝糖原含量值統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且為P＜0.01。提示黃精炮制品可以提高其肝糖原的貯存。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)正常小鼠肝糖原含量的影響（，n=10）

表2 對(duì)正常小鼠肝糖原含量的影響（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

空白對(duì)照組 - 12.925±1.78生品組 10 19.763±5.86**炆制品組 10 18.202±4.70**酒制品組 10 17.459±2.42*九蒸九曬品組 10 17.589±3.88*

3.3 小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，黃精各炮制品組的負(fù)重自由活動(dòng)時(shí)間顯著變長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)正常小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響（，n=10）

表3 對(duì)正常小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響（，n=10）

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量/g·kg-1 負(fù)重游泳時(shí)間/min空白對(duì)照組 - 10.43±2.01生品組 10 30.36±3.12*炆制品組 10 25.54±5.20*酒制品組 10 24.46±3.66*九蒸九曬品組 10 24.48±3.28*

3.4 不同炮制品對(duì)正常小鼠SOD活力以及MDA水平的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)正常小鼠SOD活力的影響，與對(duì)照組對(duì)比，生品組的值最高，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其余各組雖有一定的升高，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與生品組對(duì)比，其余各組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示：黃精藥材可以提高正常小鼠的SOD活力，尤其以生品提高最為顯著；對(duì)正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MDA水平的影響，與對(duì)照組比較，生品組以及酒制品組具有極明顯差異（P＜0.01），與生品組相比，炆制品組、酒制品組以及九蒸九曬品組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示：此藥材可以降低正常小鼠的MDA水平。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 對(duì)正常小鼠SOD活力以及MDA活力的影響（，n=10）

表4 對(duì)正常小鼠SOD活力以及MDA活力的影響（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與生品組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 劑量/g·kg-1 SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1空白對(duì)照組 - 28.46±1.06 9.20±2.15生品組 10 32.03±2.80** 3.29±1.08**炆制品組 10 28.56±1.99## 8.21±1.11##酒制品組 10 28.25±4.06## 6.55±1.22**##九蒸九曬品組 10 26.37±2.43## 10.56±2.19##

3.5 小鼠一般狀態(tài)和大體病理比較 在此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的期間內(nèi)，各給藥組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理以及精神狀態(tài)較空白對(duì)照組來(lái)說(shuō)，均無(wú)明顯的變化。待以上的操作結(jié)束后，對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了解剖，并進(jìn)行了大致的觀察，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各個(gè)內(nèi)臟沒(méi)有病理性變化。

4 討論

經(jīng)過(guò)查閱大量的文獻(xiàn)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃精可以降血糖［9-11］、抗疲勞［3］、抗氧化［12］、提高免疫［4］等功能。黃精是作為一味廣泛應(yīng)用的補(bǔ)益類(lèi)中藥，其一因?yàn)槠湫晕镀骄?，其二因?yàn)槠淇梢詮母瓷掀鸬綇?qiáng)身健體的作用。在2015年版《藥典》中，黃精的炮制品種只收錄了生品黃精和酒黃精兩種，就其炮制工藝復(fù)雜程度來(lái)說(shuō)，的確是簡(jiǎn)便，但就其藥效來(lái)說(shuō)建昌幫的炆黃精與傳統(tǒng)炮制方法的九蒸九曬黃精卻有著優(yōu)勢(shì)。

黃精作為一味藥食兩用的中藥材，研究者的研究方向應(yīng)該更多地關(guān)注到其服用后是否會(huì)給機(jī)體帶來(lái)不良的影響，而不是一味追求藥效。從表1中我們可以得知，除炆黃精外，均會(huì)引起正常小鼠的血糖升高。黃精生品對(duì)小鼠空腹血糖的影響尤為顯著，這可能與生品中黃精總多糖含量最多有關(guān)，給藥后，各炮制品組與空白對(duì)照組對(duì)比，空腹血糖值雖然有所升高，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生品黃精組與空白對(duì)照組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這組數(shù)據(jù)說(shuō)明其小鼠在給藥后空腹血糖值的升高有可能與自身的成長(zhǎng)有關(guān)，但是，是哪種因素起了主要影響尚不確定，希望可以對(duì)其機(jī)制有更深一步的研究。

疲勞，作為一種亞健康狀態(tài)，在我們的日常生活中很普遍，并且是和每一個(gè)人都相關(guān)的，但是人們并未給予足夠的重視。疲勞的主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體能量與肌肉力量的降低，伴隨著機(jī)體超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)而變化的生化指標(biāo)可作為衡量疲勞程度的參考指標(biāo)。糖在肝臟中的貯藏形式表現(xiàn)為肝糖原。增加能源物質(zhì)是消除疲勞的一條有效途徑，在長(zhǎng)時(shí)間的耐力運(yùn)動(dòng)中，它的作用體現(xiàn)在分解供能、維持血糖穩(wěn)定和肌肉收縮以及緩解中樞疲勞和外周疲勞的發(fā)生。通過(guò)表2我們可以得知：與空白對(duì)照組相比，黃精生品以及各炮制品在增加肝糖原儲(chǔ)備的量上均有很大的提高，生品組以及炆制品組具有極顯著差異（P＜0.01），酒制品組與九蒸九曬品組具有顯著差異（P＜0.05）。提示：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物負(fù)重游泳力竭時(shí)間的延長(zhǎng)與能源物質(zhì)——肝糖原貯備的提高有關(guān)。

運(yùn)動(dòng)耐力的下降是機(jī)體疲憊的最直接的表現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)耐力的測(cè)定方式有負(fù)重游泳試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)等等，其中小鼠負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)因其操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直接等原因而最為常用。游泳力竭時(shí)間越久，證明其機(jī)體耐力越好，抗疲勞的水平越厲害。通過(guò)表3我們可以得知：各給藥組均可延長(zhǎng)小鼠的游泳力竭時(shí)間，且與空白對(duì)照組對(duì)比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示肝糖原貯備量的提高可能是延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳力竭時(shí)間的一個(gè)主要原因。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，生品組的SOD最高，并且與對(duì)照組對(duì)比有明顯差異，這或許與其總多糖的多少有關(guān)，其在經(jīng)過(guò)加工后多糖大大降低，提示多糖能夠提高小鼠SOD的活力壓制MDA的水平。炆制品組SOD較空白對(duì)照組來(lái)說(shuō)均有所提高，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與黃精炮制后多糖含量減少有關(guān)；九蒸九曬品組和酒制品組的SOD活力較空白對(duì)照組反而降低了，此兩種方法或許在其它的補(bǔ)益方面有更出色的表現(xiàn)。結(jié)合SOD與MDA值的觀察，有助于全面了解機(jī)體的抗氧化水平，除九蒸九曬品組外，均低于空白對(duì)照組，提示雖然黃精炮制后黃精多糖含量大大減少，但是炆制品以及酒制品較生品水平相當(dāng)。

綜合各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)研究，結(jié)果表明黃精炆制品有著較優(yōu)的表現(xiàn)。

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