染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠臟器指數(shù)及NO/NOS的影響*

★ 麻海娟 黎曉 陳良龍 賴雪琴 曹性玲 黃志華 黃誠(chéng)**（.江西中醫(yī)藥大學(xué)05級(jí)碩士研究生 南昌 0004；.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江西 贛州4000；.贛南醫(yī)學(xué)院05級(jí)本科生 江西 贛州 4000）

隨著現(xiàn)代社會(huì)的快速發(fā)展，疲勞已成為社會(huì)常態(tài)，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。運(yùn)動(dòng)疲勞是疲勞的一種，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已嘗試采用一些方式來(lái)改善身體力量和提高康復(fù)疲勞效率，包括使用興奮劑，但這對(duì)身體會(huì)造成長(zhǎng)期的傷害［1］。傳統(tǒng)中藥多是天然植物，副作用小，有著天然的自身優(yōu)勢(shì)［2］。有研究表明從中藥提取的植物雌激素類具有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用［3-4］。染料木素（Genistein，Gen）又稱金雀異黃素、染料木黃酮、5，7，4′-三羥基異黃酮，主要來(lái)源于大豆、三葉草、葛根、槐花和槐角等，是一種天然的植物雌激素，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和提高抗氧化酶活性等功效［5-6］，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)染料木素可升高運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠全血中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，升高紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞分布寬度和血紅蛋白濃度［7］，提示染料木素具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞的功效。為進(jìn)一步闡明其可能作用機(jī)制，本研究擬以游泳力竭大鼠為模型，通過(guò)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠的臟器指數(shù)、血清NO及NO合成酶的含量，從血管內(nèi)皮功能的角度探討染料木素的抗疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠32只，體重（180±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，合格證號(hào)：43004700027319。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，自由飲水、進(jìn)食。

1.1.2 藥物與試劑 Gen由沈陽(yáng)藥科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院植化教研室提供，純度為99%，實(shí)驗(yàn)前用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，使用時(shí)用生理鹽水稀釋至所需濃度。一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase，NOS）分型測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電）；BS224S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；中佳KLC-2046型低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；LB801型超級(jí)恒溫水浴箱（湖北黃石市醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制及分組 32只雄性SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)疲勞模型組、染料木素低劑量組（0.1μmol/kg）、染料木素高劑量組（0.3μmol/kg）組，每組8只。運(yùn)動(dòng)疲勞模型制備參照馬海峰等建立的方法［8］，簡(jiǎn)述如下：將大鼠置于120×90×60 cm恒溫水箱（水溫25℃，水深40cm），進(jìn)行4天的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，每天1次，每次30min；第5～8天訓(xùn)練時(shí)間為90 min，第9～14天訓(xùn)練時(shí)間為120min。訓(xùn)練過(guò)程中發(fā)現(xiàn)力竭的情況，及時(shí)撈起，休息5min后，繼續(xù)進(jìn)行游泳訓(xùn)練。正常對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，不加任何干預(yù)。Gen組分別于每次游泳運(yùn)動(dòng)前30min給予濃度為0.05μM或0.15μM的Gen，給藥體積為2mL/kg體重皮下注射，模型組于游泳運(yùn)動(dòng)前30min給予同體積的DMSO皮下注射，正常對(duì)照組給予同體積的生理鹽水皮下注射，持續(xù)14天。

1.2.2 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)測(cè)定 末次運(yùn)動(dòng)10min后，10%水合氯醛麻醉大鼠，稱體重，取胸腺、脾臟、腎臟和腦并稱重，計(jì)算胸腺、脾臟、腎臟及腦指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/體重（g）。

1.2.3 血清NO、tNOS、cNos和iNOS含量的測(cè)定分別采用NO和NOS分型測(cè)試盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，檢測(cè)血清中NO、tNOS、cNOS和iNOS的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示，各組間測(cè)定指標(biāo)的總體比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)的影響 由圖1-4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，模型組的脾臟指數(shù)（P＜0.01）和腎臟指數(shù)（P＜0.05）明顯下降，而胸腺指數(shù)和腦指數(shù)無(wú)明顯差異。與模型組相比，染料木素組可不同程度上調(diào)胸腺指數(shù)（P＜0.05）、脾臟指數(shù)（P＜0.001）、腎臟指數(shù)（P＜0.05）和腦指數(shù)（P＜0.01）。

圖1 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠胸腺指數(shù)的影響

圖2 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠脾臟指數(shù)的影響

圖3 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠腎臟指數(shù)的影響

圖4 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠腦指數(shù)的影響

2.2 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠血清NO、tNOS、cNos和iNOS的影響 如圖5-8所示，與對(duì)照組相比，在模型組，運(yùn)動(dòng)疲勞會(huì)導(dǎo)致NO（P＜0.01）和cNOS（P＜0.01）含量顯著降低；與模型組相比，Gen組的血清 NO（P＜0.001）、tNOS（P＜0.01）和 cNOS（P＜0.01）含量明顯升高，而對(duì)iNOS無(wú)明顯影響。

圖5 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠NO的影響

圖6 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠tNOS的影響

圖7 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠iNOS的影響

圖8 染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠cNOS的影響

3 討論

在競(jìng)技體育中，運(yùn)動(dòng)員產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)疲勞是常有的事，極大地影響著運(yùn)動(dòng)員的身體健康和運(yùn)動(dòng)能力。若運(yùn)動(dòng)后能有效地消除疲勞，將有助于運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練水平的提高和身體的保護(hù)。目前產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)疲勞的機(jī)制主要有能量耗竭學(xué)說(shuō)、代謝產(chǎn)物堆積學(xué)說(shuō)、離子代謝紊亂學(xué)說(shuō)和氧自由基-脂質(zhì)過(guò)氧化學(xué)說(shuō)等多因素的綜合［9］。其中氧化應(yīng)激損傷在運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生過(guò)程中起重要作用［10］。

運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生后，臟器指數(shù)是反應(yīng)臟器是否受損的一個(gè)重要指標(biāo)，有研究表明當(dāng)動(dòng)物和人的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)出現(xiàn)異?；騼?nèi)臟出現(xiàn)病變的時(shí)候，臟器的重量就會(huì)發(fā)生改變［11］。運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)機(jī)體產(chǎn)生并釋放大量的自由基，降低機(jī)體的抗氧化能力，并損傷脾、胸腺、腎和大腦等重要組織器官，使之發(fā)生結(jié)構(gòu)變化以及器官的重量降低［12-15］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中藥對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞具有一定的緩解作用，為此，我們的研究結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠經(jīng)染料木素干預(yù)后，脾、胸腺、腎和大腦的臟器指數(shù)均明顯上調(diào)，提示染料木素可能具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞的作用。

為進(jìn)一步揭示染料木素的抗運(yùn)動(dòng)疲勞的可能機(jī)制，我們選擇從血管內(nèi)皮功能的角度來(lái)探討。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，作為一種血管舒張因子，NO能明顯起到擴(kuò)血管、降阻力、增加器官血流量的作用，從而增加運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌和心肌等組織的血流量，輸送氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及帶出代謝產(chǎn)物，保證了機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力［16-17］。另外，NO還可以穩(wěn)定溶酶體膜，抵抗自由基損傷［18］。運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)，大量產(chǎn)生的氧自由基可使NO生物活性喪失［19］。NOS是NO合成的關(guān)鍵酶，包括構(gòu)建型cNOS和誘導(dǎo)型iNOS兩種。它們可提高NO的合成能力，特別能明顯提高血清和肌組織中NO的含量，有利于在運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)過(guò)程中保持有較大的血流量，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后的恢復(fù)［20-21］?；诖?，如果我們能尋求到一些中藥可通過(guò)影響NO合成和NOS活性，就對(duì)運(yùn)動(dòng)后疲勞有改善作用。本研究結(jié)果表明，染料木素可顯著提高模型大鼠血清中因運(yùn)動(dòng)疲勞所致的NO、tNOS和cNOS含量下降，但對(duì)iNOS無(wú)明顯影響。

綜上所述，染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠具有一定改善作用，其可能機(jī)制是通過(guò)抑制運(yùn)動(dòng)疲勞導(dǎo)致的臟器損傷以及提高NO含量和NOS活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

［1］Gore RK, Webb TS, Hermes ED. Fatigue and stimulant use in military fighter aircrew during combat operations [J]. Aviat Space Envir Med,2010, 81(8):719-727.

［2］劉真,李新錄.中藥抗運(yùn)動(dòng)疲勞的研究綜述[J].體育科技文獻(xiàn)通報(bào),2011, 11(19):121-122.

［3］鄧炳楠,金宏,李培兵,等.大豆異黃酮對(duì)游泳小鼠抗疲勞能力的影響[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2012, 34(1):55-63.

［4］郭雅,習(xí)雪峰.葛根素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠海馬NO-cGMP信號(hào)系統(tǒng)的影響[J].食品科學(xué), 2012, 33(13):276-279.

［5］Li YQ, Xing XH, Wang H, et al. Dose-dependent effects of genistein on bone homeostasis in rats' mandibular subchondral bone[J]. Acta Pharmacol Sin, 2012, 33(1):66-74.

［6］Lin AH, Leung GP, Leung SW, et al. Genistein enhances relaxation of the spontaneously hypertensive rat aorta by transactivation of epidermal growth factor receptor following binding to membrane estrogen receptors-α and activation of a G protein-coupled, endothelial nitric oxide synthasedependent pathway [J]. Pharmacol Res, 2011, 63(3):181-189.

［7］蒙蘭蘭,吳麗珍,黃虎龍,等.染料木素對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠血細(xì)胞的影響[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2016, 36(6):854-859.

［8］馬海峰,吳瑛,楊銳.針刺運(yùn)動(dòng)性疲勞模型大鼠不同穴位后心肌和肝臟組織的相關(guān)變化[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2015, 19(27): 4 282-4 287.

［9］You L, Zhao M, Regenstein JM. In vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of loach (Misgurnus anguillicaudatus) peptides prepared by papain digestion[J]. Food Chemistry, 2011, 124(1), 188-194.

［10］Power SK, DeRuisseau KC, Quindry J. Dietary antioxidants and exercise[J]. Sports Sci, 2004, 22(1):81-94.

［11］徐曉陽(yáng),張愛(ài)芳,武桂新,等.扶正力氣中藥對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠糖代謝某些指標(biāo)的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 1998, 17(3):221-226.

［12］Tkachuk MG. Changes in the structural components of the thymus gland with different degrees of adaptation of the body to physicalloads [J].Arkh Anal GistolEmbriol, 1984, 86(5):80-84.

［13］Baldwin DR, Wileox ZC, Baylosis RC. Impact of differential housing on humoral immunity following exposure to an acute stressor in rats [J].PhysiolBehav, 1995, 57(4):649-653.

［14］Gruzdera ON, Chikhman UN. The structure of the white pulp of the spleen and peripheral blood indices in rats under increased muscle activity [J]. Mortologia, 1999, 116(6):65-68.

［15］劉斌焰,邢雁霞,郭敏芳,等.松針對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠腦組織熱休克蛋白70表達(dá)的影響[J]. 2017, 33(1):65-67.

［16］Espey MG, Miranda KM, Feelish M, et al. Mechanisms of cell death governed by the blance between it rosative and oxidatives tress [J]. Ann N Y AcadSci, 2000, 899(2-3):209-221.

［17］Hussain, Sabah N. A. et al. Expression of nitric oxide synthase isoforms in normal ventilatoty and limb muscles [J]. ApplPhysiol, 1997, 83(2):348-353.

［18］Flora SJ. Role of free radicals and antioxidants in health and disease.Cell MolBiol (Noisy-le-grand), 2007, 53(1):1-2.

［19］吳曉華,閆金輝,蔡書景,等.通竅活血湯加減對(duì)缺血性腦卒中患者NO及tNOS、iNOS寒冷的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014, 23(22): 2 402-2 404.

［20］Roberts CK. Postexercise increase in nitric oxide in football players with muscle cramps[J]. Pm.J.Sports Med, 1998, 26(6):820-824.

［21］Koizumi T, Hermo CI. Nitric oxide and nitro-glycerin reversal of pulmonary vasoconstriction induced by alpha-activation during exercise[J]. AM J Physiol, 1996, 270(2):875-880.