川芎嗪對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用*

★ 林文新 馬阮昕 馮真英（1.廣州市皮膚病防治所 廣州 510095；.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院藥學(xué)部 廣州 510655；.湛江市第二人民醫(yī)院 廣東 湛江 5400）

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó) Gibco公司）；川芎嗪（南京廣潤(rùn)生物制品有限公司）；過(guò)氧化氫（重慶川東化工有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、一氧化氮（NO）試劑盒，均購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)，選取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物劑量設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分組為：正常對(duì)照組、H2O2模型組（300μmol/L）、川芎嗪+H2O2（20nmol/L+300μmol/L）低劑量組、川芎嗪+ H2O2高劑量組（100nmol/L+300μmol/L）及陽(yáng)性對(duì)照 Vit C + H2O2組（200mg/L+300 mol/L）。制備H2O2模型前，預(yù)先用不同濃度的川芎嗪處理川芎嗪+ H2O2低劑量組和高劑量組的PC12細(xì)胞，而陽(yáng)性對(duì)照組加相應(yīng)濃度的Vit C處理PC12細(xì)胞，孵育24h后，洗滌除去培養(yǎng)基后，再加入300μmol/L的H2O2孵育24h制備氧化損傷模型。即除正常對(duì)照組外，其余各組均加入相應(yīng)濃度的H2O2和藥物培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24h后，檢測(cè)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.4 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率 PC12細(xì)胞在含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，先加入不同濃度川芎嗪（10～1000nmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)1h，然后加入300μmol/L的H2O2孵育24h后，接著每孔加入20μL噻唑藍(lán)（MTT，12mmol/L），37℃孵育4h，倒去上清液， 每孔加入二甲基亞砜（DMSO） 100μL，振蕩 3min，30min內(nèi)在960全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)570nm處的吸光度值。另外，將1.3處理的PC12細(xì)胞孵育24h后，同樣按照上述MTT的操作步驟加入相對(duì)應(yīng)的干預(yù)藥物和H2O2， 測(cè)量570nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖百分率。

1.5 LDH活性的測(cè)定 PC12細(xì)胞處理同1.3，PC12細(xì)胞在10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的川芎嗪（20nmol/L和100nmol/L）以及Vit C（200mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)24h，再加入終濃度為300μmol/L H2O2刺激細(xì)胞4h，收集細(xì)胞外液。加入50μL的1% SDS，然后收集細(xì)胞層的細(xì)胞內(nèi)液，用日立7170生化自動(dòng)分析儀測(cè)定細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)液中的LDH活性，以培養(yǎng)液中LDH活性單位占培養(yǎng)液加細(xì)胞層中LDH總活性單位的百分比作為L(zhǎng)DH釋放的百分率。

1.6 MDA、SOD、NO的檢測(cè) PC12細(xì)胞處理同1.3，各組細(xì)胞給藥時(shí)間結(jié)束后，收集各組培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。以TBA法測(cè)定MDA含量；以黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD含量；以硝酸還原酶法測(cè)定NO含量。具體的檢測(cè)步驟按各試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用ANVOA進(jìn)行組間均數(shù)比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的活力影響 從表1可知，與0nmol/L比較組比較，隨著川芎嗪劑量的升高，PC12細(xì)胞的存活率顯著增加（P＜0.01），但并不呈劑量依賴(lài)性，反而是逐漸降低；且1000nmol/L川芎嗪干預(yù)后，PC12細(xì)胞的存活率顯著降低（P＜0.05）。因此本實(shí)驗(yàn)選擇20nmol/L和100nmol/L的川芎嗪分別作為低劑量和高劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

從表2可知，與正常組比較，模型組的PC12細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，川芎嗪+ H2O2低劑量、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照Vit C + H2O2組中細(xì)胞活力皆顯著提高（P＜0.01）。

表1 川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞的活力影響（，n=6）

表1 川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞的活力影響（，n=6）

注：與0nmol/L比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

0 50.0±6.5 10 96.6±4.1**50 85.4±1.9**100 80.7±2.8**200 75.3±3.4**500 51.2±1.6**1000 39.8±0.5*

表2 各組藥物干預(yù)對(duì)PC12細(xì)胞的活力影響（，n=6）

表2 各組藥物干預(yù)對(duì)PC12細(xì)胞的活力影響（，n=6）

注：與H2O2模型對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常對(duì)照組 98.0±4.5##H2O2模型對(duì)照組 54.3±5.1川芎嗪+ H2O2低劑量組 98.3±5.7##川芎嗪+ H2O2高劑量組 81.0±4.1##陽(yáng)性對(duì)照 Vit C + H2O2組 95.3±3.4##

2.2 川芎嗪對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的LDH釋放的百分率 從表3可知，與H2O2模型對(duì)照組比較，川芎嗪+ H2O2低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照 Vit C + H2O2組的LDH釋放率均顯著降低，提示這些組的PC12細(xì)胞的存活率顯著增加（P＜0.01）。

表3 川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞的LDH釋放的百分率（，n=6）

表3 川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞的LDH釋放的百分率（，n=6）

注：與H2O2模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組 百分率/%正常對(duì)照組 63.6±8.4**H2O2模型對(duì)照組 85.8±2.7川芎嗪+ H2O2低劑量組 58.8±3.0**川芎嗪+ H2O2高劑量組 60.1±2.1**陽(yáng)性對(duì)照 Vit C + H2O2組 64.4±1.4**

2.3 川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞的MDA、SOD、NO的影響 從表4可知，與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞MDA水平顯著增加，SOD和NO含量顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，川芎嗪+ H2O2低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照 Vit C + H2O2組的細(xì)胞MDA水平顯著減少，SOD和NO含量顯著增加（P＜0.05）。

表4 川芎嗪對(duì)PC12細(xì)胞的MDA、SOD、NO的影響（，n=6）

注：與模型組比較，#P＜0.05,，##P＜0.01。

3 討論

川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，本品辛溫行散，入血走氣，上行頭顛，下走血海。善活血行氣，祛風(fēng)止痛。治血瘀氣滯諸痛，兼寒者最宜，被前人譽(yù)為“血中之氣藥”。川芎嗪作為中藥川芎的有效成分，臨床上主要用于治療缺血性心腦血管疾病。另有研究表明，川芎嗪對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)均有不同程度的藥理作用。而研究川芎嗪對(duì)神經(jīng)方面的氧化應(yīng)激的研究較少。因此，本研究就著重探討川芎嗪對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激的作用。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動(dòng)物、植物和微生物等。它是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，其在生物體內(nèi)的水平高低是衰老與死亡的直觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的SOD比正常對(duì)照組顯著減少，說(shuō)明模型細(xì)胞的自由基清除能力降低。而用川芎嗪干預(yù)后，SOD含量比模型細(xì)胞的顯著增加，這說(shuō)明了給藥后可對(duì)抗因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，減少氧化應(yīng)激引起的自由基造成的細(xì)胞傷害。

本實(shí)驗(yàn)中H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的MDA比正常對(duì)照組顯著減少，而NO比正常對(duì)照組顯著減少，說(shuō)明模型細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度增強(qiáng)和細(xì)胞損傷明顯。而用川芎嗪干預(yù)后，MDA含量比模型細(xì)胞的顯著減少，而NO含量比模型細(xì)胞的顯著增加，這說(shuō)明了給藥后有緩解氧化應(yīng)激的作用，減少模型細(xì)胞的損傷。

綜上所述，川芎嗪通過(guò)減少H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的MDA和LDH水平，增加SOD和NO水平，進(jìn)而緩解該細(xì)胞模型的氧化應(yīng)激，可見(jiàn)川芎嗪具有一定的抗氧化作用，這也為進(jìn)一步考察它的作用機(jī)制和臨床使用提供指導(dǎo)作用。

［1］鄭延松,李源,張珊紅,等. 用低濃度過(guò)氧化氫建立心肌細(xì)胞氧化損傷模型[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 22(20):1 849-1 851.

［2］張斌,夏作理,趙曉民,等. 氧化應(yīng)激模型的建立及其評(píng)價(jià)[J].中國(guó)臨床康復(fù), 2006, 44(10):112-114.

［3］楊雪梅.川芎嗪藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志, 2010,31(3):215-217.

［4］嚴(yán)鋼莉,李朝武,聶海嶺,等. 丹參川芎嗪注射液對(duì)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制研究[J]. 卒中與神經(jīng)疾病, 2016,23(1):15-20.