干性記憶型T細胞及其在抗腫瘤研究中的進展

李 莉 陸小凡 趙煥英 計云霞 劉利鋒 粟 斌

(艾滋病研究北京市重點實驗室 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069)

伴隨CAR-T細胞療法獲得FDA批準正式上市以來，足以改變癌癥治療模式的過繼免疫治療(AIT)成為人們持續(xù)關注的熱點。AIT目前大多采用分化終末期的效應T細胞，而且其療效與過繼轉移T細胞的數(shù)量有關。研究表明中晚期T細胞回輸后，其擴增及存活能力均不如早期T細胞，例如Klebanoff等〔1〕觀察了中心記憶型T細胞(TCM)和效應型T細胞(TEM)分別輸注于接種腫瘤細胞的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在體內TCM比TEM具有更持久的存活時長和更好的抗腫瘤效果。究其原因，TCM較TEM具有自我更新和分化為效應細胞的能力。那么，新近發(fā)現(xiàn)的干性記憶型T細胞(TSCM)，它們具有更強的增殖和自我更新能力，可能成為T細胞過繼性免疫治療一個新的亮點。

1 TSCM的表型及功能特點

1.1TSCM的發(fā)現(xiàn) 根據細胞表面淋巴結歸巢標志(CCR7或CD62L)和蛋白酪氨酸磷酸酶CD45(CD45RA或CD45RO)的表達，記憶型T細胞可分為TCM、TEM〔2,3〕。以往研究認為，記憶型T細胞由初始T細胞在受到抗原刺激時分化產生，經由TCM，最終分化為TEM，但在2005年，美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院Zhang等〔4〕在研究小鼠移植物抗宿主反應疾病(GVHD)時發(fā)現(xiàn)一群低表達CD44(CD44lo),高表達CD62Lhi及干細胞抗原,同時表達Bcl-2，CD122(IL-2和IL-15受體)的CD8+T細胞，這群細胞具有干細胞樣的特點，被命名為“TSCM”。在2009年，Gattinoni等〔5〕在小鼠身上進一步證實了這群細胞的存在。直到2011年，這一個新的記憶型T淋巴細胞亞群在人類外周血中被Gattinoni等〔6〕發(fā)現(xiàn)，因此，由于TSCM亞群的發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的T細胞分化模式被打破，T細胞分化模式改變?yōu)椋撼跏糡細胞→TSCM→TCM→TEM。致此，TSCM被認為是最早期分化的，存在時間最長的記憶型T細胞。

1.2TSCM的表型特征 TSCM存在于小鼠、靈長類動物及人類。在人類外周血中，約占CD4+或CD8+T細胞的2%～4%，歸巢于淋巴結。TSCM與初始T細胞具有相似的細胞表型，均具有CD45RA+CD45RO-CCR7+CD27+，但是，與初始T細胞不同的是，TSCM高表達CD95和CD122(IL-2Rβ)(兩者均為TCM和TEM所表達的細胞表面標志)。人類TSCM還高表達BCL-2、CXCR3、CXCR4、LFA-1等T細胞分化標志物，而低表達CD38和CD31。

1.3TSCM的功能特征

1.3.1有分泌細胞因子的能力 TSCM具有與TCM和TEM相似的特性，即當再次遇到抗原刺激時，記憶型T細胞能夠快速反應，發(fā)揮其效應功能。Gattinoni等〔6〕發(fā)現(xiàn)：CD8+TSCM細胞在抗CD3/CD28/CD2等多克隆刺激下，可以分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN)-γ和白細胞介素(IL)-2等細胞因子，而初始T細胞則不具有這些特性，當再次遇到抗原刺激時保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

1.3.2具有自我更新和多能分化的潛能 研究表明〔6〕：CD8+TSCM在IL-15存在下，連續(xù)培養(yǎng)10 d，約有60%的TSCM細胞保持CD45RA+的特征，即CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+，而TCM僅有30%保持原細胞表型，即CD45RA+CD45RO+CCR7+CD62L+，因此，TSCM細胞比TCM細胞具有更強的自我更新的能力。同時還證實TSCM在抗CD3/CD28/CD2等多克隆刺激下，部分TSCM細胞逐漸表現(xiàn)為CD45RO表達上調，CD62L和CCR7的表達下調，進一步分化為TCM和TEM。TCM約占TSCM子代的50%,TEM約占4%，約有15%的TSCM細胞保持母代表型特征。Cieri等〔7〕觀察TSCM在人骨髓移植的分化情況時，亦證實了TSCM可以進一步分化為TCM和TEM。所以，與TCM和TEM相比，TSCM具有再生、多能分化等干細胞特性，具有產生所有記憶型T細胞的能力。Klebanoff等〔8〕的研究亦證實了這一發(fā)現(xiàn)：將不同的T細胞亞群對小鼠進行輸注，以腫瘤的縮減程度作為評判指標，T細胞分化程度和抗腫瘤效果之間存在著明顯的負相關關系，即分化程度越低的T細胞亞群，其抗腫瘤效果越強大，TSCM>TCM>TEM。

1.3.3具有增殖能力 一個CD8+TSCM在IL-15存在的培養(yǎng)基中可以快速分裂成2個子細胞，其中，一個子細胞保持原母代細胞特性，另一個子細胞進一步向下分化為其他類型的T細胞(包括TCM和TEM等)。CD4+TSCM在IL-7的存在下具有相似的增殖能力〔9〕，因此，TSCM一部分保持靜息狀態(tài)，具有進一步增殖及分化的潛能。

2 TSCM與抗腫瘤作用及機體免疫

2.1TSCM的抗腫瘤作用 在小鼠的在體實驗中，TSCM與其他類型的T細胞相比，具有自我更新的能力及更強的抗腫瘤能力〔5,6,10〕。這些特性的具備，使得TSCM療法可以克服現(xiàn)有的免疫治療缺點，如T細胞植入低下、持久性差及不能形成長久的免疫反應等。

Gattinoni等〔5〕證實，TSCM在小鼠腹腔過繼性T細胞治療的第二次診療中，可以分化成TCM和TEM亞群。Cieri等〔10〕證實在移植物抗宿主病小鼠模型中，TSCM被證實在淋巴結及非淋巴組織中，均具有植入、增殖等能力，且是初始細胞和TCM的10～100倍。值得注意的是，TEM已被用于臨床試驗中，但植入體的增殖及存活能力較差，無法在體內維持長時間的免疫應答。在NSG小鼠模型中，TSCM較初始T細胞和T細胞其他亞群更具自我復制和存活能力。

T細胞的增殖和存活能力與過繼性T細胞治療的抗腫瘤效率密切相關〔6〕。T細胞受體(TCR) 或嵌合抗原受體(CAR)基因工程是目前臨床應用的針對靶標的特異性循環(huán)T細胞的技術。Gattinoni等〔6〕應用這一技術制備針對間皮素特異的記憶型T細胞的各亞群，以檢測對于腫瘤模型的抵抗作用。間皮素特異TSCM、TCM、TEM細胞注射入嚴重免疫缺陷小鼠(NSG小鼠)的腹腔內。發(fā)現(xiàn)TEM介導的抗腫瘤能力最差，并伴有腹水等癥狀，與對照組相比，小鼠的生存率未見明顯改觀；TCM治療較TEM治療有效，提高了小鼠的生存率，但在治療后的40 d內，小鼠均死于腫瘤的進展。與此明顯相反的是，TSCM細胞在小鼠體內激發(fā)對腫瘤的抑制，除部分小鼠(2只)在2～3 w內死亡外，其余小鼠(6只)獲得治愈或腫瘤明顯縮小。移植TSCM細胞造成的小鼠晚期死亡的原因主要是由于移植物抗宿主反應所致的體重下降。由此可見，在小鼠模型中，過繼性TSCM細胞治療較TCM 和TEM細胞治療具有更強的抗腫瘤能力和更好的治療效果。而對骨髓移植患者的治療研究發(fā)現(xiàn)，以TSCM為靶點的T細胞治療方案可能具有比TCM和TEM更安全、有效的治療效果〔11〕。在血液腫瘤中，TSCM細胞被認為是免疫記憶的決定因素之一，監(jiān)測TSCM細胞的水平對血液腫瘤骨髓移植后的預后有重要意義〔12〕。

2.2TSCM與機體免疫 TSCM細胞在維持機體細胞免疫功能中亦具有重要作用〔13〕。長期的抗病毒治療過程中，人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)特異性CD8+TSCM介導的CTL反應有助于機體產生持久的體液免疫反應〔14〕。HIV慢性期感染患者CD8+TSCM細胞與疾病進展具有一定的相關性〔15〕。另外，TSCM細胞在其他感染性疾病中也充分顯示了其在機體細胞免疫中的作用。對41種黃熱病毒減毒疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，黃熱病毒特異性CD8+TSCM細胞可以穩(wěn)定存在25年以上且仍具有再生能力〔16〕，由此可見，與TCM和TEM細胞相比，TSCM細胞具有更強的再生、抗病毒和抗腫瘤能力。然而，CD4+TSCM細胞極易被HIV病毒感染，其胞內HIV-1DNA含量雖不是最高，隨著HIV治療時間的延長，CD4+TSCM細胞逐漸成為HIV病毒貯存庫的主要成員〔17,18〕，因此，檢測HIV感染的CD4+TSCM細胞水平成為有效控制HIV感染的重要評價指標之一。

2.3TSCM細胞在腫瘤免疫治療中的潛能 有兩個基因治療的臨床試驗對TSCM細胞在腫瘤免疫治療中的可能性進行了探索，這些臨床試驗均以在體長時程T細胞改造為特點。實驗者追蹤了接受基因治療者的1 700個T細胞克隆的命運，實驗證實TSCM細胞在基因改造的干細胞融合后保持存在長達12年之久，對TSCM細胞的安全、功能、生存期等的驗證，均說明了其具有臨床應用的潛能〔11〕。Sabatino等〔19〕進行了臨床級別的CD-19特異的CAR修飾的CD8+TSCM細胞治療B細胞惡性腫瘤的實驗，實驗表明，CD19-CAR 修飾的CD8+TSCM 顯示更強的代謝適應性，對急性淋巴細胞白血病移植瘤具有持久的抗腫瘤反應且反應穩(wěn)定，這一實驗為一期臨床試驗奠定基礎。

雖然臨床前動物實驗已經證實TSCM細胞具有非常有效的抗腫瘤的作用〔5,6〕，但是，過繼性TSCM細胞治療距離臨床應用尚有很長的路要走，需要跨過的障礙之一就是如何擴增得到足夠數(shù)量的TSCM細胞，這方面的研究正方興未艾。Cieri等〔10〕和Gattinoni等〔6〕分別用IL-7/IL-15 、Wnt/β-catenin通路中糖原合成 (GSK)-3β的抑制劑TWSl19聯(lián)合IL-7/IL-21對體外人TSCM進行擴增，取得較好的效果；van der Waart等〔20〕干擾Akt信號通路獲得具有MiHA-特異性、CCR7+CD62L+早期記憶型CD8+T細胞。我國在這方面也做了初步嘗試，馬星如等〔21〕用生長分化因子11(GDF11)對CD8+T細胞進行體外擴增，隨著CD8+T 細胞數(shù)量的增加，相應的TSCM細胞數(shù)量也隨之顯著地增加，并在培養(yǎng)的第3周達到增殖高峰。這些有效的嘗試，為TSCM細胞盡快應用于臨床抗病毒和抗腫瘤的過繼型性免疫治療，提供了新的可行的技術手段和方法。

TSCM具有干細胞的特性，自我更新和進一步分化的能力。Biasco等〔11〕首次證實用于基因治療的TSCM細胞是安全的，并具有持續(xù)性存活能力。隨著TSCM體外擴增的技術和方法的成熟，以及CAR-T細胞療法在國外臨床應用及我國這方面的初步的嘗試，基于TSCM的特點，將其應用過繼性免疫細胞治療，及基于CART技術將其應用于腫瘤治療，將指日可待，從而開啟免疫治療及腫瘤治療的新的篇章。