噪聲暴露對(duì)大鼠ABR反應(yīng)閾及下丘中小清蛋白、鈣視網(wǎng)膜蛋白及鈣結(jié)合蛋白表達(dá)的影響*

徐濤 羅彬 孫敬武 劉叢利 宋朝

噪聲性聽(tīng)力損失是一種常見(jiàn)后天性感音神經(jīng)性聾的，多因長(zhǎng)期噪聲環(huán)境暴露或短時(shí)強(qiáng)噪聲暴露所致，表現(xiàn)為暫時(shí)性閾移或永久性閾移。聲創(chuàng)傷后聽(tīng)覺(jué)通路中變化主要有機(jī)械損傷學(xué)說(shuō)、氧化自由基學(xué)說(shuō)、鈣離子平衡失調(diào)學(xué)說(shuō)、谷氨酸興奮性中毒學(xué)說(shuō)及興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的變化學(xué)說(shuō)等[1～5]；鈣離子作為細(xì)胞信號(hào)通路中的第二信使，通過(guò)與鈣結(jié)合蛋白(calcium-binding proteins，CBPs)作用，參與細(xì)胞遷移、胞外分泌、細(xì)胞間的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和信息調(diào)控、細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)；緩沖蛋白作為CBPs家族成員，主要參與對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)控，其中以小清蛋白(parvalbumin，PV)和鈣視網(wǎng)膜蛋白(calretinin，CR)最具代表性，鈣結(jié)合蛋白D-28K(calbindin D-28K，CB)也被廣泛的研究。研究表明，PV、CR和CB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富，其特異性地、互不重疊地表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)能中間神經(jīng)元的亞群中，并具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。下丘(inferior colliculus，IC)作為聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路上的重要中繼站，擁有豐富的神經(jīng)元，本研究擬通過(guò)觀察噪聲暴露后大鼠IC中PV、CR及CB表達(dá)水平變化，探討噪聲暴露后中樞傳導(dǎo)通路的變化，進(jìn)一步探討噪聲致耳聾、耳鳴的可能發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取2～3月齡、體重200～250 g的健康雄性SPF級(jí)SD大鼠22只，隨機(jī)分成對(duì)照組(8只)和噪聲組(14只)；所有動(dòng)物經(jīng)檢查，全身無(wú)明顯畸形，耳廓反射存在，耳鏡檢查無(wú)明顯異常；無(wú)耳毒性藥物接觸史及強(qiáng)噪聲暴露史；雙耳ABR反應(yīng)閾均在25 dB SPL以下。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1噪聲暴露方法 動(dòng)物經(jīng)腹腔注射7%的水合氯醛(500 μl/kg)麻醉后行ABR檢測(cè)，然后噪聲組大鼠于隔聲室內(nèi)置入專用保溫器皿內(nèi)，右耳用耳模橡膠封堵，左側(cè)外耳道朝向揚(yáng)聲器(上海創(chuàng)木，CP-75A)，揚(yáng)聲器距外耳道口約3 cm，暴露于中心頻率為16 kHz、帶寬為一個(gè)倍頻程、聲強(qiáng)為116 dB SPL的噪聲(由專業(yè)人員經(jīng)Adobe audition3，Version 3軟件合成)，暴露1小時(shí)后保溫復(fù)蘇；對(duì)照組大鼠置于相同容器內(nèi)遠(yuǎn)離噪聲暴露源，保溫至蘇醒。

1.2.2ABR檢測(cè) 所有動(dòng)物在噪聲暴露前及暴露后第7天用Tucker-Davis Technologies 系統(tǒng)3(TDT，美國(guó))檢測(cè)雙耳ABR。大鼠兩耳連線與頭頂正中矢狀線交點(diǎn)處接正電極，鼻尖接地電極，檢測(cè)耳對(duì)側(cè)乳突處接負(fù)電極，分別以8、12、16、20、24及32 kHz短音閉合聲場(chǎng)給聲，刺激間隔為10次/秒，揚(yáng)聲器(TDT公司，EC1)軟管置于檢測(cè)耳外耳道內(nèi)，采集波的濾波范圍為300～3 000 Hz，疊加1 024次；聲強(qiáng)自100 dB SPL開(kāi)始以5 dB梯度逐次降低； ABR波形采集記錄及分析由BioSigRP軟件(TDT公司)完成，反應(yīng)閾判斷標(biāo)準(zhǔn)為記錄的ABR波形中波Ⅲ剛消失且兩次檢測(cè)波形不重合時(shí)的最小聲強(qiáng)加5 dB。

1.2.3下丘PV、CR及CB表達(dá)量檢測(cè) 噪聲暴露后第7天完成ABR測(cè)試后，麻醉狀態(tài)下斷頭，快速取出兩組大鼠腦組織，置于富氧的低溫人工腦脊液中，于震動(dòng)切片機(jī)(德國(guó) LEICA，VT1200S)中對(duì)腦組織進(jìn)行冠狀位切片，始自尾端，層厚約300 μm，對(duì)照大鼠腦譜圖分別取出雙側(cè)下丘組織；細(xì)胞裂解液(上海生工，PL005)低溫裂解30 min后取上清液，采用BSA試劑盒(上海生工，SK3051)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，以上樣緩沖液均一濃度后充分混勻，置入沸水中浴10 min后室溫冷卻，行蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)：分離電壓120 V，轉(zhuǎn)膜電流280 mA，一抗為Swant公司CB300(1∶1 000)、CR7699/3H(1∶1 000)、PV235(1∶1 000)，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自Bio-rad公司，內(nèi)參β-tubulin(1∶1 000)采用Cell Signaling公司產(chǎn)品，使用Millpore公司進(jìn)口分裝二抗，發(fā)光試劑盒由Bio-rad公司提供，法國(guó)Vilber Lourmat，F(xiàn)usion Solo 2作凝膠成像及圖像采集。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Graphpad 5.0作圖，圖像結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，灰度值越大，表示表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1兩組ABR反應(yīng)閾比較 噪聲暴露前兩組動(dòng)物雙耳各頻率ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間反應(yīng)閾比較亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)；噪聲暴露后第7天，噪聲組大鼠暴露耳8、12、16、20、24及32 kHzABR反應(yīng)閾均較噪聲暴露前顯著升高，發(fā)生了顯著的閾移(P<0.001)，而對(duì)照組雙耳反應(yīng)閾及噪聲組非暴露耳反應(yīng)閾較暴露前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.2兩組大鼠下丘PV、CR及CB表達(dá)量 噪聲暴露后第7天，噪聲組大鼠暴露側(cè)下丘PV和CR的表達(dá)量較非暴露側(cè)顯著增加，分別增加了21.80%(P<0.05)和30.79%(P<0.01)(表2)，且噪聲組大鼠非暴露側(cè)下丘中PV及CR表達(dá)量較對(duì)照組雙側(cè)平均表達(dá)量亦顯著增加，分別增加61.39%及17.91%(P<0.01)；而噪聲組兩側(cè)下丘中CB的平均表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，較對(duì)照組下降19.63%(P<0.05)，但兩側(cè)的表達(dá)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2，圖1～3)。

表1 各頻率兩組噪聲暴露前及暴露后第7天左、右耳ABR反應(yīng)閾

注：*與噪聲組噪聲暴露前雙耳及噪聲暴露后非暴露耳比較，P<0.001

表2 暴露后第7天PV、CR及CB蛋白在對(duì)照組及噪聲組左、右側(cè)下丘中表達(dá)

注：*與對(duì)照組均值及同組右側(cè)下丘比較，P<0.05；△與對(duì)照組雙側(cè)平均值比較，P<0.01

圖1 噪聲暴露后第7天噪聲組與對(duì)照組IC中PV的表達(dá)

圖2 噪聲暴露后第7天噪聲組與對(duì)照組IC中CR的表達(dá)

圖3 噪聲暴露后第7天噪聲組與對(duì)照組IC中CB的表達(dá)

3 討論

研究顯示，在噪聲暴露后早期，實(shí)驗(yàn)對(duì)象多表現(xiàn)為ABR反應(yīng)閾升高，多認(rèn)為與短期的內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變有關(guān)，包括柱狀體的屈曲膨脹、螺旋器變性塌陷、毛細(xì)胞靜纖毛的損傷以及耳蝸內(nèi)電位的抑制等[7]；將南美栗鼠清醒狀態(tài)下暴露于中心頻率4 kHz、帶寬一個(gè)倍頻程、聲強(qiáng)為86 dB SPL的噪聲場(chǎng)中24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有動(dòng)物噪聲暴露后4～12 kHz ABR反應(yīng)閾顯著提高，平均值為43 dB SPL[7]；本課題組也曾將大鼠在清醒狀態(tài)下暴露于頻率4 kHz以上、100 dB SPL的白噪聲中，在暴露后0.5～2小時(shí)后大鼠雙耳ABR反應(yīng)閾較暴露前均顯著提高，提高15～50 dB不等，但是經(jīng)休息后逐漸恢復(fù)，至暴露后第14天，反應(yīng)閾基本恢復(fù)正常[8]。文中結(jié)果顯示，將大鼠在中心頻率16 kHz、帶寬一個(gè)倍頻程、聲強(qiáng)116 dB SPL的噪聲環(huán)境中暴露1 h后，8、12、16、20、24及32 kHz頻率ABR反應(yīng)閾均顯著升高，與以往大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露的聲強(qiáng)、頻率及暴露時(shí)間與聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損傷及損傷后修復(fù)程度也存在著很大的聯(lián)系[9]；Browne等[10]將大鼠在麻醉狀態(tài)下單耳暴露于中心頻率16 kHz、1/10倍頻程、115 dB SPL噪聲中1小時(shí)，測(cè)得所有動(dòng)物暴露耳ABR反應(yīng)閾均提高，但在暴露后第8天低頻反應(yīng)閾基本恢復(fù)正常，而高頻(16 kHz和32 kHz)反應(yīng)閾無(wú)明顯變化，并且在暴露后第16天，除1 kHz較第8天無(wú)顯著變化外，其余頻率反應(yīng)閾均再次升高，暴露后第32天，所有頻率的反應(yīng)閾較暴露后第8天均顯著升高；指出在暴露后第8天低頻段聽(tīng)閾的恢復(fù)提示在外周聽(tīng)覺(jué)器官或中樞聽(tīng)覺(jué)通路中可能同時(shí)存在著修復(fù)與適應(yīng)的過(guò)程，認(rèn)為，暴露后早期的反應(yīng)閾提高系因耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞及外毛細(xì)胞的損傷導(dǎo)致，而閾值下降后又再次升高可能是外周聽(tīng)覺(jué)器官與中樞聽(tīng)覺(jué)通路發(fā)生了一系列的改變導(dǎo)致；且噪聲暴露后單純的毛細(xì)胞損傷、修復(fù)與適應(yīng)可能不能完全解釋噪聲暴露后聽(tīng)閾的變化，噪聲暴露后還可能導(dǎo)致耳鳴等癥狀。Turner等[11]在2006年以驚跳反射的行為方法檢測(cè)出大鼠經(jīng)與本研究相同噪聲環(huán)境及暴露條件后出現(xiàn)了耳鳴癥狀；有研究證實(shí)，噪聲暴露可以導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)通路中一系列興奮性和抑制性反應(yīng)的失衡[4]。下丘作為聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路中的重要中繼站，其分層結(jié)構(gòu)具有對(duì)音頻定位的功能，也是聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路中神經(jīng)元數(shù)量最多的部位之一[12]，并且其解剖位置恒定。因此，通過(guò)下丘觀察噪聲暴露后大鼠ABR反應(yīng)閾改變時(shí)聽(tīng)覺(jué)通路的變化也是可靠的。

CBPs作為具有神經(jīng)保護(hù)功能的蛋白質(zhì)家族，已被證明由神經(jīng)元的活動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)，被廣泛用于研究聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)變化。從本研究結(jié)果看，噪聲暴露后第7天，暴露組動(dòng)物暴露側(cè)下丘中PV和CR的表達(dá)量較非暴露側(cè)顯著增加，且非暴露側(cè)下丘中PV和CR的表達(dá)量較對(duì)照組雙側(cè)下丘的平均表達(dá)量也顯著增高。Idrizbegovic等[13]研究發(fā)現(xiàn)，噪聲刺激后，小鼠下丘中PV和CB免疫陽(yáng)性的神經(jīng)元中兩種蛋白的表達(dá)量顯著增加，指出，由于CBPs的神經(jīng)保護(hù)作用，噪聲過(guò)度刺激后，這些神經(jīng)元中CBPs家族成員PV和CB表達(dá)量的增加可能是它們對(duì)過(guò)度刺激的保護(hù)作用。然而，噪聲暴露后第7天，本研究測(cè)得噪聲組大鼠的CB表達(dá)量較對(duì)照組降低，Browne等[10]也測(cè)得噪聲暴露后當(dāng)天暴露側(cè)聽(tīng)皮層及耳蝸核中CB的表達(dá)量明顯減少，到第32天，耳蝸核中CB表達(dá)量有所提高，他們認(rèn)為，CB在暴露后的減少可能是由于暴露后聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)過(guò)分的興奮毒性導(dǎo)致CB合成紊亂，影響了其作為胞質(zhì)鈣的緩沖功能，從而不再能夠保護(hù)細(xì)胞免受興奮性毒性損傷，隨著聽(tīng)覺(jué)功能的修復(fù)，CB的表達(dá)量在暴露后第32天再次上升。

Forster等[14]曾行大鼠單側(cè)耳蝸切除，觀察大鼠單耳聽(tīng)力損失后中樞聽(tīng)覺(jué)通路中CB的變化，發(fā)現(xiàn)在單耳聽(tīng)力損失同側(cè)的下丘中央核中CB陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，認(rèn)為這是聽(tīng)覺(jué)腦干神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)為了調(diào)整信號(hào)的突然變化而產(chǎn)生的適應(yīng)性改變。然而，在本研究中，噪聲暴露后第7天并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)暴露組兩側(cè)下丘中CB表達(dá)量存在顯著性差異，且噪聲組CB的表達(dá)量較對(duì)照組下降；可能是由于本研究?jī)H觀察到噪聲暴露后第7天，有一定的局限性，噪聲暴露后下丘CB的表達(dá)量可能在更短期或遠(yuǎn)期發(fā)生著變化，這有待于今后進(jìn)一步觀察。

CB在中樞聽(tīng)覺(jué)通路中的表達(dá)量還會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)[15]，故實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類、大小、月齡及實(shí)驗(yàn)條件、方法的不同，對(duì)研究結(jié)果均可能有影響。此外，本研究在噪聲組中，采用耳模橡膠封堵非暴露耳，雖然非暴露耳ABR反應(yīng)閾較暴露前及對(duì)照組無(wú)顯著差異，但非暴露側(cè)下丘中PV、CR表達(dá)量顯著高于對(duì)照組雙側(cè)下丘的平均值，提示噪聲暴露仍有可能通過(guò)骨導(dǎo)影響非暴露耳，這也有可能在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，噪聲暴露后大鼠ABR反應(yīng)閾升高，下丘PV、CR表達(dá)水平上升，CB表達(dá)水平下降，這些變化可能參與了噪聲性聾、耳鳴及其它聽(tīng)覺(jué)功能異常的發(fā)病機(jī)制。

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