探討HBV—DNA定量檢測核酸提取過程中的影響因素分析

崔紅艷

[摘要] 目的 探討HBV-DNA（乙肝病毒的脫氧核糖核酸）定量檢測核酸提取過程中的影響因素。方法 方便選取2018年1—4月內(nèi)蒙古赤峰市中心血站經(jīng)ELISA檢測兩次的75份合格血液樣本為研究對象，分別統(tǒng)計不同濃縮液劑量、不同沉淀搖勻方式和不同裂解煮沸時間的Ig HBV-DNA測定結(jié)果，并對各項結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 不同濃縮液組別的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方式相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.140、0.036、0.069、1.088，P>0.05）；B1（4.123±0.187）和B4（4.235±0.160）與標(biāo)準(zhǔn)方式（4.178±0.175）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.437、2.082，P<0.05），B2（4.136±0.189）、B3（4.201±0.162）與標(biāo)準(zhǔn)方式相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.412、0.835，P>0.05）；C1（4.134±0.160）與標(biāo)準(zhǔn)方式（4.203±0.155）對比，明顯偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.682，P<0.05），C2（4.195±0.138）、C3（4.232±0.167）和C4（4.221±0.169）與標(biāo)準(zhǔn)方式對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.334、1.102、0.679，P>0.05）。 結(jié)論 一定范圍內(nèi)適當(dāng)改變濃縮劑量、沉淀搖勻方式和裂解煮沸時間并不會對檢測結(jié)果造成較大影響，但經(jīng)過預(yù)熱處理后，振蕩搖勻會促使核酸釋放和沉淀混勻，臨床上要注意相關(guān)因素的影響，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞] HBV-DNA；定量檢測；核酸提?。挥绊懸蛩?/p>

[中圖分類號] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）10（c）-0029-03

[Abstract] Objective To investigate the influencing factors of nucleic acid extraction in HBV-DNA （deoxyribonucleic acid）. Methods From January to April 2018， 75 qualified blood samples were tested by ELISA in the blood bank of Chifeng City Center in Inner Mongolia. The doses of different concentrates， different sedimentation methods and different pyrolysis time were counted of Ig HBV-DNA assay results， and statistical analysis of the results was implemented. Results The results of different concentrate groups were not significantly different from the standard methods （t=0.140， 0.036， 0.069， 1.888， P>0.05）； B1 （4.123±0.187） and B4 （4.235±0.160） Compared with the standard method （4.178±0.175）， the difference was statistically significant （t=2.437， 2.082， P<0.05）， B2 （4.136±0.189）， B3 （4.201±0.162） compared with the standard method， the difference was not statistically significant（t=1.412， 0.835， P>0.05）； C1 （4.134±0.160） was significantly lower than the standard method（4.203±0.155）， the difference was statistically significant （t=2.682， P<0.05）， C2（4.195±0.138）， C3 （4.232±0.167） and C4（4.221±0.169） were compared with the standard method， the difference was not statistically significant（t=0.334， 1.102， 0.679， P>0.05）. Conclusion Appropriate changes in concentration dose， sedimentation and pulverization boiling time within a certain range will not have a great impact on the test results， but after pre-heat treatment， shaking will promote the release of nucleic acid and precipitation， clinically pay attention to the influence of relevant factors to improve the accuracy of the test results.

[Key words] HBV-DNA； Quantitative detection； Nucleic acid extraction； Influencing factors

慢性乙型肝炎是臨床上發(fā)病率較高的一類疾病，主要是指受檢者的乙肝病毒檢測結(jié)果呈陽性，HBsAg陽性率在10%以下。熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR技術(shù)、雜交技術(shù)和光譜技術(shù)，通過采集和分析熒光，達(dá)到對原始模板進(jìn)行定量的目的[1-3]。核酸DNA模板的提取過程是關(guān)系到定量結(jié)果的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，尤其是對于病毒水平偏低的樣本，產(chǎn)生的影響會更加突出。該研究以2018年1—4月中心血站經(jīng)ELISA檢測兩次的75份合格血液樣本為研究對象，旨在分析HBV-DNA定量檢測核酸提取過程中的影響因素，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究方便中心血站經(jīng)ELISA檢測兩次的75份合格血液樣本為研究對象，其中，檢出HBV真陽性25例，其中包括男性15例，女性10例；年齡最大52歲，年齡最小21歲，平均年齡為（38.86±2.31）歲。非活動性HBsAg攜帶者20例，其中包括男性11例，女性9例；年齡最大51歲，年齡最小20歲，平均年齡為（38.75±2.46）歲。輕度慢性乙型肝炎受檢者30例，其中包括男性18例，女性12例；年齡最大50歲，年齡最小20歲，平均年齡為（38.96±2.54）歲。所有入選病例均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且患者和家屬知情同意。

1.2 研究方法

濃縮液：標(biāo)準(zhǔn)組的濃縮液劑量為100 μL，A1的濃縮液劑量為90 μL，A2的濃縮液劑量為95 μL，A3的濃縮液劑量為105 μL，A4的濃縮液劑量為110 μL。五組除濃縮液劑量不同外，其余操作方式均按照說明書的要求進(jìn)行操作。

沉淀搖勻方式：標(biāo)準(zhǔn)組的沉淀搖勻方式為直接敲打混勻15 s，B1的沉淀搖勻方式為漩渦振蕩儀振蕩15 s，B2組沉淀搖勻方式為漩渦振蕩儀振蕩30 s，B3沉淀搖勻方式為56℃預(yù)熱120 s再漩渦振蕩15 s，B4沉淀搖勻方式為56℃預(yù)熱180 s再漩渦振蕩15 s。五組除沉淀搖勻方式不同外，其余操作方式均按照說明書的要求進(jìn)行操作。

裂解煮沸時間：標(biāo)準(zhǔn)組的裂解煮沸時間為10 min，C1的裂解煮沸時間為6 min，C2的裂解煮沸時間為8 min，C3的裂解煮沸時間為12 min，C4的裂解煮沸時間為14 min。5組除裂解煮沸時間不同外，其余操作方式均按照說明書的要求進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)

①對不同劑量濃縮液與標(biāo)準(zhǔn)濃縮液的測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，并對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

②對不同搖勻方式與標(biāo)準(zhǔn)方式的測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，并對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

③對不同裂解時間與標(biāo)準(zhǔn)方式的測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，并對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.4 統(tǒng)計方法

該研究中的所有數(shù)據(jù)均納入SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件中，計數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗；計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)方式與不同劑量濃縮液的測定結(jié)果對比分析

不同濃縮液組別的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方式相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)方式與不同搖勻方式的測定結(jié)果對比分析

B1（漩渦振蕩儀振蕩15 s）和B4（56℃預(yù)熱180 s再漩渦振蕩15 s）與標(biāo)準(zhǔn)方式相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），B2、B3與標(biāo)準(zhǔn)方式相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)方式與不同裂解時間的測定結(jié)果對比分析

C1（裂解煮沸時間為6 min）與標(biāo)準(zhǔn)方式對比，明顯偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），C2、C3和C4與標(biāo)準(zhǔn)方式對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

3 討論

實時熒光定量PCR技術(shù)可以反映出患者體內(nèi)的HBV感染情況，同時也可以評估治療后的恢復(fù)情況，為臨床診療提供指導(dǎo)。采用此種方法進(jìn)行檢測，不需要進(jìn)行PCR后處理，可有效的避免發(fā)生交叉感染，提高了定量的準(zhǔn)確性，是目前用于乙肝和其他傳染病的主要技術(shù)[4-6]。但PCR的檢測結(jié)果仍然會受到一些因素的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。該研究對較為常見的3種影響因素進(jìn)行進(jìn)一步的分析和探討，在堅持方便操作、結(jié)果準(zhǔn)確的原則基礎(chǔ)上，對濃縮劑量、沉淀混勻方式和煮沸裂解時間等提取核酸的關(guān)鍵性影響因素進(jìn)行研究，現(xiàn)進(jìn)行具體分析。

首先，分析濃縮液劑量對檢測結(jié)果的影響。濃縮液本身的粘稠度相對較高，如果在檢測過程中出現(xiàn)加樣槍使用不規(guī)范或不標(biāo)準(zhǔn)的情況，這則會導(dǎo)致在加入檢測管的過程中出現(xiàn)加入量過多或加入量不足的情況。上述情況往往會出現(xiàn)在剛剛進(jìn)入臨床實習(xí)的學(xué)生或是剛進(jìn)入臨床工作的相關(guān)人員身上，一些工作經(jīng)驗豐富的工作人員出現(xiàn)此類錯誤的可能性是非常小的。因此，上述結(jié)果可能會產(chǎn)生的影響并不是很明確，該研究在其他條件都不改變的情況下，改變濃縮液的劑量，再進(jìn)行測試。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示，濃縮液劑量上，不同濃縮液組別的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方式相比無顯著差異，這說明在確保嚴(yán)格執(zhí)行說明書操作規(guī)范的情況下，對濃縮液劑量進(jìn)行適當(dāng)增減，并不會影響最終的測定結(jié)果。

其次，分析沉淀搖勻方式對檢測結(jié)果的影響。雖然采用敲打混勻的方式，可以讓沉淀徹底溶解，但此種方法會導(dǎo)致EP管破裂造成污染，而不同操作人員的敲打時間和敲打力度都是存在一定差異的，這對于操作的規(guī)范化是非常不利的。采用高速漩渦振蕩儀則可以很好的彌補(bǔ)這一缺陷，并且可以對敲打時間和敲打力度進(jìn)行有效控制，檢測出管底部受力是否均勻。在該組研究結(jié)果中，B1（4.123±0.187）和B4（4.235±0.160）與標(biāo)準(zhǔn)方式（4.178±0.175）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，B2（4.136±0.189）、B3（4.201±0.162）與標(biāo)準(zhǔn)方式相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這說明其余兩種方式可成為替代操作方式，對核酸的釋放可起到有利作用，沉淀溶解可以更加完全[7-8]。

最后，分析煮沸時間對檢測結(jié)果的影響。在工作中，往往會因為多種因素影響煮沸時間，煮沸時間不夠或者是煮沸時間相對較長，則會導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性受到不同程度的影響。C1（4.134±0.160）與標(biāo)準(zhǔn)方式（4.203±0.155）對比，明顯偏低，C2（4.195±0.138）、C3（4.232±0.167）和C4（4.221±0.169）與標(biāo)準(zhǔn)方式對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明煮沸時間不夠，病毒難以完全釋放，會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。這與黎茵[9]報道中的結(jié)果相似，黎茵報道中提出，標(biāo)準(zhǔn)組與旋渦混勻15 s組（4.125±0.186）以及56℃預(yù)熱180 s（4.199±0.164）后在旋渦沉淀混勻15 s組之間存在較大差異，裂解煮沸時間6min組（4.195±0.138）和裂解煮沸時間10 min組（4.222±0.168）之間的差異較大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述，一定范圍內(nèi)適當(dāng)改變濃縮劑量、沉淀搖勻方式和裂解煮沸時間并不會對檢測結(jié)果造成較大影響，但經(jīng)過預(yù)熱處理后，振蕩搖勻會促使核酸釋放和沉淀搖勻。

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（收稿日期：2018-07-28）