化學誘導小鼠先天性腎積水動物模型的實驗研究

劉靖　劉明學　劉星　魏光輝

【摘要】 目的：探討一種化學誘導小鼠先天性腎積水動物模型的方法。方法：將C57BL/6J孕鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只。在第12個妊娠日（GD），對照組采用玉米油灌胃，實驗組采用2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（TCDD）灌胃。GD18，統(tǒng)計胎鼠的數(shù)量、存活率以及畸形發(fā)生情況。分析胎鼠及孕鼠各主要臟器組織學結構，電鏡觀察胎鼠輸尿管和腎臟的超微結構。結果：GD18，對照組胎鼠的輸尿管和腎臟均正常。實驗組胎鼠腎積水發(fā)生率為100%（3級86.2%，4級13.8%）。實驗組胎鼠下段和中段輸尿管黏膜層移行上皮增生，管腔狹窄，輸尿管上皮細胞核仁明顯，靠邊，核大，染色質豐富，異染色質少，常染色質發(fā)達；腎間質纖維化，腎小管結構模糊，上皮細胞腫脹，膜性結構破裂。對照組胎鼠腎積水發(fā)生率低于實驗組。結論：TCDD所誘導的胎鼠腎積水動物模型，與人類腎盂輸尿管連接處梗阻（UPJO）在病理學表現(xiàn)上類似，可用于UPJO發(fā)病機制與病因學等方面的研究。

【關鍵詞】 小鼠； 先天性腎積水； 動物模型

Study on Animal Model of Congenital Hydronephrosis Induced by Chemical in Mice/LIU Jing，LIU Mingxue，LIU Xing，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：033-036

【Abstract】 Objective：To explore a kind of chemical method that can induce animal model of congenital hydronephrosis in mice.Method：C57BL/6J dams were randomly divided into the experimental group and the control group，ten mice in each group.Pregnant mice in the control group were given corn oil with intragastric administration，2，3，7，8-tetrachlorodibenzodioxin（TCDD） was given to pregnant mice with same method in the experimental group on gestational day（GD） 12.Teratogeny of fetus was distinguished，number and survival rate of fetus were calculated，main organs of fetus and dams were gain for histology analysis，ultramicrostructure of fetal ureter and kidney was observed with transmission electron microscope（TEM），on GD18.Result：On GD18，fetal ureters and kidneys were normal in the control group，incidence rate of hydronephrosis in fetus were 100%（grade 3 was 86.2%，grade 4 was 13.8%） in the experimental group.Epithelial proliferation in mucous membrane of inferior and middle ureter，narrow ureter lumina was found in hydronephrosis fetus.Renal interstitial fibrosis，epithelial cells of nephric tubule was swollen with vague and break structure， epithelial cells of ureter was shown with gross nucleoli，big nucleus，rich caryotin，few heterochromatin，and prosperous euchromatin which were found by TEM in the experimental group，on GD18. Hydronephrosis incidence of fetal in the control group was less than that of the experimental group.Conclusion：The animal model with congenital hydronephrosis was constructed with TCDD in fetal mice is similar to human ureteropelvic junction obstruction（UPJO） in pathology，is useful for study on pathogenesy and aetiology of UPJO.

【Key words】 Mice； Congenital hydronephrosis； Animal model

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.009endprint

絕大部分先天性腎積水為腎盂輸尿管連接處梗阻（UPJO）所導致[1-3]。迄今為止，在針對UPJO發(fā)病機制與病因學方面的研究中，還沒有比較理想的動物模型供采用。國外有文獻報道，多種動物的先天性腎積水是由2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（TCDD）誘發(fā)的 [4-7]，其中以C57BL/6J小鼠最為敏感。本研究擬采用TCDD誘導C57BL/6J小鼠先天性腎積水，通過觀察組織病理學及超微結構表現(xiàn)，評估以該方式建立UPJO所致腎積水動物模型的可行性?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試動物 由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供的10～12周齡清潔級C57BL/6J小鼠，飼養(yǎng)于清潔級籠具，設置環(huán)境濕度為55%±5%，溫度為23～25 ℃，光照為12 h/12 h明暗交替。適應新環(huán)境一周后，雌雄鼠合籠交配，雌鼠外陰出現(xiàn)陰栓當日作為第0個妊娠日（GD）。

1.1.2 主要試劑 美國Sigma-Aldrich公司提供TCDD和玉米油；北京化學試劑公司提供多聚甲醛；蘇木精染液、伊紅染液、鹽酸酒精、二甲苯、中性樹膠、4%戊二醛、1%鋨酸、甲苯胺藍、醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛由重慶川東化工有限公司化學試劑廠提供。

1.1.3 主要儀器 H-600透射電鏡由日本Hitachi公司提供；解剖顯微鏡由日本Nikon公司提供；顯微攝像系統(tǒng)、光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與處理 孕鼠被隨機分為對照組與實驗組，每組10只。GD12，對照組采用玉米油灌胃，實驗組采用TCDD（25 μg/kg，用玉米油配制成2 μg/mL）灌胃。GD18，處死孕鼠，取孕鼠的心臟、肝臟、肺和腎臟等主要器官用作組織學觀察。統(tǒng)計胎鼠的存活情況及數(shù)量，有無吸收胎及死胎，對胎鼠進行稱重后處死，解剖胎鼠，觀察胎鼠是否存在畸形，對胎鼠各主要臟器進行組織學觀察。在兩組胎鼠中各隨機抽取1只，取其腎臟和輸尿管，用于超微結構觀察。

1.2.2 組織學觀察 以4%多聚甲醛固定孕鼠及胎鼠各臟器標本6 h，石蠟包埋、切片，再進行蘇木精-伊紅（HE）染色。以下為具體操作步驟：切片經二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，蘇木精染液染色5～15 min，0.5%鹽酸酒精分色30 s，流水沖洗15～30 min，0.1%伊紅染液染色2 min，再經70%、85%、95%、100%酒精梯度脫水，每級脫水2～3 min，二甲苯透明2次，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 腎積水程度分級 參照文獻[8]，根據積水的程度，將胎鼠腎積水分為五級。

1.2.4 透射電鏡觀察 4 ℃條件下，以4%戊二醛將切割成約0.1 cm3大小的新鮮胎鼠腎臟組織與輸尿管預固定2 h，0.1M PBS漂洗3次。1%鋨酸固定1 h后，再以0.1M PBS漂洗3次。丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制備半薄切片，甲苯胺藍染色，光學顯微鏡定位。最后制備超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察和照相。

2 結果

2.1 TCDD對孕鼠的影響 兩組孕鼠均無脫毛，皮毛色澤光亮，活動、飲水及攝食正常，無早產及流產，各主要臟器大體解剖與組織學表現(xiàn)均正常。

2.2 TCDD對胎鼠的影響 對照組胎鼠共68只，無腭裂表現(xiàn)，膀胱、雙側輸尿管及腎臟均正常，其余各主要臟器也均正常。實驗組胎鼠共65只，均伴有腭裂，下段輸尿管及膀胱外觀正常，雙側上段輸尿管及腎盂積水擴張明顯，輸尿管中段扭曲、折疊（圖1），其余各臟器均正常。兩組胎鼠均為活胎，無吸收胎及死胎。

注：①為對照組，②為實驗組。白色箭頭指示為腎盂，黑色箭頭指示為輸尿管。

2.3 胎鼠組織學分析結果 在實驗組，腎積水發(fā)生率為100%，且均為雙側腎積水，其中9只胎鼠18個腎臟表現(xiàn)為雙側4級腎積水（占13.8%）；56只胎鼠112個腎臟表現(xiàn)為雙側3級腎積水（占86.2%）；組織學表現(xiàn)腎間質纖維化，中下段輸尿管黏膜移行上皮增生致使管腔狹窄。對照組輸尿管、腎臟組織學表現(xiàn)均正常。對照組胎鼠腎積水發(fā)生率低于實驗組。胎鼠腎臟、輸尿管在GD18的組織學表現(xiàn)，見圖2。

2.4 透射電鏡分析結果 相對于對照組，實驗組胎鼠輸尿管上皮細胞常染色質發(fā)達，染色質豐富核大，核仁明顯，靠邊，異染色質少；腎小管上皮細胞結構模糊，腫脹，可見破裂的膜性結構。

3 討論

目前，主要有以下幾種建立腎積水動物模型的方法：第一種，為使輸尿管完全梗阻或不完全梗阻而形成腎積水，目前較多采用手術方式包埋或結扎輸尿管[9-11]，這種腎積水成模方法不適用于先天性腎積水發(fā)病機制以及病因學方面的研究，因其與先天性腎積水相差太遠，僅用于輸尿管梗阻后腎臟代謝功能與腎臟病理學改變等方面的研究。第二種，某些動物的自發(fā)性先天性腎積水，是由于基因突變后出現(xiàn)的，可以經定向培育而保留下來。有學者發(fā)現(xiàn)了一個新的C57BL/6J小鼠突變品系，25%的仔鼠出生后2～4周死于雙腎積水導致的氮質血癥，其雙側腎積水是由于雙側腎盂輸尿管連接部進行性梗阻所致[12]。但其他學者研究了同一突變品系的小鼠后并沒有發(fā)現(xiàn)器質性梗阻，只是水通道蛋白2的正常運輸功能因為基因突變而受干擾，導致尿液濃縮缺陷，出現(xiàn)純合子多飲的癥狀，產生大量低滲尿引起腎積水，所以該品系小鼠出現(xiàn)的腎積水是功能性的，而非器質性梗阻所致[13]。Friedman等[14]學者發(fā)現(xiàn)一種先天性腎積水大鼠，大部分為單側腎積水，有多尿癥狀，伴有低滲尿，血尿素氮升高，無明確的尿路梗阻，這種腎積水與人類的UPJO無可比性，估計也是由于大量低滲尿所致。在Tauchi等[15]所報道的先天性腎積水大鼠中，同樣也未發(fā)現(xiàn)尿路梗阻。這類自發(fā)性先天性腎積水具有人為影響因素少的優(yōu)點，缺點是：種類相對少，來源較困難，在病理學改變上與人類UPJO沒有十分肯定的相似之處。第三種，先天性腎積水可由某些藥物誘導出現(xiàn)。Dawrant等[16]在CBA/Ca小鼠中，采用阿霉素成功誘導出了VACTERL畸形，該畸形中的雙側腎積水發(fā)生率達100%。但該方法誘導的腎積水也不適于用作人類UPJO的動物模型，因為這種雙側腎積水繼發(fā)于膀胱發(fā)育不全，且伴發(fā)太多的其他器官畸形。此外，基因工程也可用于制備腎積水動物模型[17-18]，但目前該技術本身存在的一些缺陷有待解決，還處于進一步完善提高的階段[19]。endprint

在本實驗中，筆者采用C57BL/6J小鼠建立先天性腎積水的動物模型。C57BL/6J小鼠具有遺傳背景清楚、壽命長、腫瘤自然發(fā)生率低、容易飼養(yǎng)等優(yōu)點，廣泛應用于發(fā)育生物學的研究，在轉基因小鼠的生產中也經常被用到。C57BL/6J小鼠通常被作為標準的近交系小鼠，在生物醫(yī)學研究領域廣泛使用。本實驗采用TCDD在C57BL/6J胎鼠中成功地誘導出了先天性雙側腎積水，發(fā)生率高達100%。給予25 ?g/kg的TCDD灌胃后，孕鼠主要臟器未出現(xiàn)病理性損害，一般狀況良好，無吸收胎與死胎，無流產及早產，表明低劑量TCDD不影響小鼠的晚期妊娠。組織學分析結果表明，實驗組胎鼠的中、下段輸尿管黏膜移行上皮增生，引起輸尿管管腔狹窄，導致輸尿管不完全梗阻，最終形成腎積水。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實驗組胎鼠的輸尿管上皮細胞核仁明顯，染色質豐富，核大，表明輸尿管上皮細胞增殖活躍，印證了組織學表現(xiàn)。在UPJO的病因中，腎盂輸尿管連接處狹窄最常見，占UPJO病因的90%以上。國內學者對狹窄部位組織進行研究后發(fā)現(xiàn)，該部位病理改變具有多樣性：狹窄部位黏膜及固有層淋巴細胞浸潤，黏膜充血水腫；部分患者出現(xiàn)輸尿管移行上皮細胞增生，少數(shù)呈乳頭狀增生，移行上皮細胞增生可多達6～10層；平滑肌改變可表現(xiàn)為肌內纖維增生、平滑肌變薄、平滑肌增多增粗、輸尿管內外肌層分界不清、平滑肌結構紊亂[20]。TCDD所致胎鼠腎積水在組織病理學改變上類似于人類腎盂輸尿管連接處狹窄——UPJO的最主要病理類型，其相似性表現(xiàn)為輸尿管移行上皮增生引起輸尿管管腔狹窄，導致輸尿管不完全梗阻，最終形成腎積水。

因此，在病理學表現(xiàn)上，TCDD誘導出的胎鼠腎積水動物模型與人類UPJO相似，成模率高，可靠性和可重復性高，在妊娠敏感期一次低劑量灌胃即可成模，操作簡便、可控性強、經濟易行，對孕鼠干擾小，可用于UPJO發(fā)病機制及病因學等方面的研究。

本研究僅對妊娠第18天的胎鼠進行了觀察，TCDD所誘導的胎鼠腎積水是否會像人類腎積水一樣在出生后發(fā)生變化，還需進一步研究。

參考文獻

[1]張金哲.張金哲小兒外科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：1336.

[2] Esposito C，Bleve C，Escolino M，et al.Laparoscopic transposition of lower pole crossing vessels（vascular hitch） in children with pelviureteric junction obstruction[J].Transl Pediatr，2016，5（4）：256-261.

[3] Reis S T，Leite K R，Viana N I，et al.MMP9 overexpression is associated with good surgical outcome in children with UPJO：Preliminary results[J].BMC Urol，2016，16（1）：44.

[4] Ricke W A，Lee C W，Clapper T R，et al.In Utero and Lactational TCDD Exposure Increases Susceptibility to Lower Urinary Tract Dysfunction in Adulthood[J].Toxicol Sci，2016，150（2）：429-440.

[5] Aida-Yasuoka K，Yoshioka W，Kawaguchi T，et al.A mouse strain less responsive to dioxin-induced prostaglandin E2 synthesis is resistant to the onset of neonatal hydronephrosis[J].Toxicol Sci，2014，141（2）：465-474.

[6] Yoshioka W，Kawaguchi T，F(xiàn)ujisawa N，et al.Predominant role of cytosolic phospholipase A2α in dioxin-induced neonatal hydronephrosis in mice[J].Sci Rep，2014，4：4042.

[7] Kransler K M，McGarrigle B P，Olson J R.Comparative developmental toxicity of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in the hamster，rat and guinea pig[J].Toxicology，2007，229（3）：214-225.

[8] Liu M，Liu J，Liu X，et al.Peroxiredoxin I protein，a potential biomarker of hydronephrosis in fetal mice exposure to 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin[J].J Pediatr Urol，2014，10（3）：474-481.

[9] Tveitar?s M K，Skogstrand T，Leh S，et al.Matrix Metalloproteinase-2 Knockout and Heterozygote Mice Are Protected from Hydronephrosisand Kidney Fibrosis after Unilateral Ureteral Obstruction[J].PLoS One，2015，10（12）：e0 143 390.endprint

[10] Peleli M，Al-Mashhadi A，Yang T，et al.Renal denervation attenuates NADPH oxidase-mediated oxidative stress and hypertension in rats with hydronephrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2016，310（1）：F43-56.

[11] Chan C J，Srougi V，Tanno F Y，et al.Percutaneous puncture of renal calyxes guided by a novel device coupled with ultrasound[J].Int Braz J Urol，2015，41（5）：953-958.

[12] Horton C E Jr，Davisson M T，Jacobs J B，et al.Congenital progressive hydrone-phrosis in mice：a new recessive mutation[J].J Urol，1988，140（5 Pt 2）：1310-1315.

[13] McDill B W，Li S Z，Kovach P A，et al.Congenital progressive hydronephrosis（cph） is caused by an S256L mutation in aquaporin-2 that affects its phosphorylation and apical membrane accumulation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（18）：6952-6957.

[14] Friedman J，Hoyer J R，McCormick B，et al.Congenital unilateral hydronephrosis in the rat[J].Kidney Int，1979，15（5）：567-571.

[15] Tauchi K，Kanehara H.Hypertension and the renin-angiotensin system in the congenital hydronephrosis rat with non-obstructive pelviureteric junction abnormalities[J].Exp Nephrol，1996，4（1）：60-64.

[16] Dawrant M J，Giles S，Bannigan J，et al.Adriamycin produces a reproducible teratogenic model of vertebral，anal，cardiovascular，tracheal， esophageal， renal， and limb anomalies in the mouse[J].J Pediatr Surg，2007，42（10）：1652-1658.

[17] McHugh K M.Megabladder mouse model of congenital obstructive nephropathy：genetic etiology and renal adaptation[J].Pediatr Nephrol，2014，29（4）：645-650.

[18] Liu J，Sun L，Shen Q，et al.New congenital anomalies of the kidney and urinary tract and outcomes in Robo2 mutant mice with the inserted piggybac transposon[J].BMC Nephrol，2016，17（1）：98.

[19] Haruyama N，Cho A，Kulkarni A B.Overview：engineering transgenic constructs and mice[M].Curr Protoc Cell Biol，2009，Chapter 19：Unit 19.10.

[20]謝小志，蔡正林，張海燕，等.先天性腎盂輸尿管連接處狹窄的臨床病理分析[J].臨床與實驗病理學雜志，2004，20（3）：379-380.

（收稿日期：2017-09-07） （本文編輯：程旭然）endprint