基于有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征的中藥荷葉質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

王夢(mèng)林 巴寅穎 武秋紅 李文霞 路東波 高園園 孔靜 范圓圓 黃玉娟 孫仁弟 黃廣偉 姜艷艷 石任兵

荷葉為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血的作用[1]。荷葉作為藥食同源中藥品種，在保健品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。荷葉的藥效作用研究主要集中在減肥、調(diào)節(jié)脂代謝、抗氧化、降血糖等方面[2-7]。荷葉化學(xué)成份類型主要涉及黃酮類、生物堿類，以及有機(jī)酸類、甾類、揮發(fā)油類、蛋白質(zhì)類等[8-9]。其中黃酮類成分主要為金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、紫云英苷等[10～11]，生物堿類成分主要為荷葉堿、O-去甲荷葉堿、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、蓮堿、去甲烏藥堿等[12-14]。2020版中國(guó)藥典以荷葉堿的含量作為荷葉飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]。另有文獻(xiàn)報(bào)道：采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對(duì)荷葉中6種黃酮類成分(槲皮素、蘆丁、金絲桃苷、山奈素、紫云英苷和異鼠李素)[15]、2種黃酮類成分(蘆丁、槲皮素)和1種生物堿類成分(荷葉堿)[16]進(jìn)行含量測(cè)定；采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定荷葉中的4種生物堿(荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿和蓮堿)含量[17]；采用HPLC法建立不同產(chǎn)地荷葉飲片的指紋圖譜，指認(rèn)出2個(gè)黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷)和1個(gè)生物堿類成分(荷葉堿)，以蘆丁為參照，對(duì)11個(gè)共有指紋峰進(jìn)行了相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積表征，對(duì)12批荷葉飲片進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)[18]；另有指認(rèn)出1個(gè)黃酮類成分(槲皮素)，并以槲皮素為參照，對(duì)10個(gè)共有指紋峰進(jìn)行了相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積表征，對(duì)10批荷葉飲片進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)[19]。

本研究在本課題組前期建立的基于藥物體系的中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)模式基礎(chǔ)上[20-25]，進(jìn)一步開展基于有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征的中藥荷葉質(zhì)量評(píng)價(jià)，即以確定具有降血糖作用的荷葉飲片作為飲片基準(zhǔn)，以其有效特征指標(biāo)性成分荷葉堿作為質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)，建立荷葉有效基準(zhǔn)特征圖譜；繼而以荷葉堿對(duì)照品模擬基準(zhǔn)點(diǎn)，得到11個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積；5個(gè)特征代表性成分，其中3種黃酮類成分(金絲桃苷、紫云英苷、異槲皮苷)和2種生物堿類成分(荷葉堿、O-去甲荷葉堿)的相對(duì)含量、含量換算系數(shù)；即涵蓋了荷葉的主要化學(xué)類型。并以基于此模擬基準(zhǔn)點(diǎn)的荷葉飲片有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)尺，應(yīng)用于14批荷葉樣品質(zhì)量?jī)?yōu)次的精準(zhǔn)評(píng)價(jià)，同時(shí)也為有關(guān)藥物的質(zhì)量有效評(píng)價(jià)和控制提供了參考。

1 材料

1.1 主要儀器

沃特世2695型高效液相色譜儀，沃特世 2998 PDA檢測(cè)器，Empower軟件系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器，Sartorius BT 25S型1/100 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，Sartorius BT 124S 型1/10 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 主要試藥與試劑

金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)B20631)、荷葉堿對(duì)照品(批號(hào)B20500)、O-去甲荷葉堿對(duì)照品(批號(hào)B51051)、異槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)B21529)、紫云英苷對(duì)照品(批號(hào)B21704)，對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，且純度均≥98%；乙腈(色譜級(jí))購(gòu)自 Fisher Scientific 公司；娃哈哈純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；甲醇(分析純)，購(gòu)自北京化工廠。15批荷葉飲片購(gòu)自云南、北京、河北各藥店，北京中醫(yī)藥大學(xué)的劉春生教授鑒定其均為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉。15批飲片樣品現(xiàn)均存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系，15批荷葉飲片編號(hào)、購(gòu)買地及批號(hào)、產(chǎn)地見表1。

表1 荷葉飲片編號(hào)、購(gòu)買地、批號(hào)及產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 荷葉有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法的建立

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿對(duì)照品6.85 mg、8.81 mg、2.35 mg、4.07 mg、6.48 mg，分別置于5 mL的容量瓶中，加入溶劑(70%甲醇溶液)，超聲并使其溶解后用溶劑定容至刻度線，分別搖勻，即得濃度為1.370 mg/mL、1.762 mg/mL、0.470 mg/mL、0.814 mg/mL、1.296 mg/mL的金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿對(duì)照品母液，精密吸取以上各母液適量于容量瓶中，加入70%甲醇稀釋，制備濃度為0.685 mg/mL、0.352 mg/mL、0.094 mg/mL、0.163 mg/mL、0.259 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取0.5 g荷葉飲片(基準(zhǔn))粗粉，精密稱定后將其轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶中，精密加入30 mL 溶劑(70%甲醇)，加蓋瓶塞后稱定其質(zhì)量，加熱回流提取2小時(shí)，待錐形瓶冷卻至室溫后，稱定其質(zhì)量，用溶劑補(bǔ)足失重并搖勻，用微孔濾膜(直徑0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜檢測(cè)條件 Waters XBridge C18 色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-緩沖液(B)梯度洗脫(緩沖液組成為水∶磷酸∶三乙胺= 600∶1.2∶2.4)(梯度洗脫條件見表2)，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，進(jìn)樣量為15 μL。混合對(duì)照品及荷葉供試品(基準(zhǔn))溶液的HPLC圖譜見圖1。通過11個(gè)特征峰的紫外吸收?qǐng)D譜指認(rèn)其所屬化學(xué)類型(如圖1)，色譜圖中所關(guān)注的11個(gè)共有特征峰分離度良好，其中，圖譜中1、2、7、10、11號(hào)特征峰屬于生物堿類化學(xué)成分，3～6、8、9號(hào)特征峰屬于黃酮類化學(xué)成分，該圖譜體現(xiàn)了荷葉主要化學(xué)成分類型(生物堿類和黃酮類)。11個(gè)特征峰中，5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)特征峰分別是金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷，屬于黃酮類；7號(hào)、11號(hào)特征峰分別是O-去甲荷葉堿、荷葉堿，屬于生物堿類。

注:A 荷葉樣品(270nm); B 混合對(duì)照品(270nm);1～2、10生物堿類；3～4、9黃酮類；5金絲桃苷；6異槲皮苷；7 O-去甲荷葉堿；8紫云英苷；11荷葉堿。

表2 HPLC梯度洗脫條件

2.1.4 有效基準(zhǔn)特征圖譜方法學(xué)考察 (1)精密度考察：分別精密吸取“2.1.2”中荷葉飲片(基準(zhǔn))供試品溶液15 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，選定荷葉堿為參照峰，計(jì)算各色譜峰與參照峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間。計(jì)算結(jié)果顯示：各色譜峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均分別小于1.87%、1.85%，表明儀器精密度良好，并且符合特征圖譜要求(RSD≤3%)[26]。(2)穩(wěn)定性考察：分別精密吸取同一個(gè)“2.1.2”中荷葉飲片(基準(zhǔn))供試品溶液15 μL，并于第0、2、4、8、12、24 小時(shí)分別對(duì)其進(jìn)樣分析，選定荷葉堿為參照峰，計(jì)算各色譜峰與參照峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間。計(jì)算結(jié)果顯示：各色譜峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間的RSD均分別小于2.87%、2.75%，表明荷葉樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(RSD≤3%)[26]。(3)重復(fù)性考察：取同一批基準(zhǔn)荷葉飲片，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，對(duì)其分別進(jìn)樣分析，選定荷葉堿為參照峰，計(jì)算各色譜峰與參照峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。計(jì)算結(jié)果顯示：各色譜峰的相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間的RSD均分別小于1.99%、1.96%，說明該方法重復(fù)性良好(RSD≤3%)[26]。

2.1.5 特征代表性成分含量測(cè)定方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察：精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，用70%甲醇溶液稀釋，制備一系列濃度不同的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下的色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定各色譜峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制各對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。計(jì)算結(jié)果顯示，線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99，符合測(cè)定要求(r≥0.99)[26]。結(jié)果見表3。(2)精密度考察：按照“2.1.3”項(xiàng)下的色譜檢測(cè)條件，分別精密吸取同一個(gè)“2.1.2”項(xiàng)下荷葉飲片(基準(zhǔn)、S1)的供試品溶液 15 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，以上各對(duì)照品峰面積RSD分別為0.83%、1.85%、1.62%、1.95%、1.26%，精密度良好(RSD均小于3%)，符合含量測(cè)定要求(RSD≤3%)[26]。(3)穩(wěn)定性考察：按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備荷葉飲片(基準(zhǔn)、S1)的供試品溶液，于室溫下放置，并于制備后第0、2、4、8、12、24 小時(shí)，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，以上各對(duì)照品峰面積RSD分別為1.07%、1.80%、2.27%、2.63%、1.23%(RSD均小于3%)，表明荷葉供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(RSD≤3%)[26]。(4)重復(fù)性考察：按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備同一個(gè)荷葉飲片(基準(zhǔn)、S1)的供試品溶液，平行制備6份，進(jìn)樣，按照“2.1.3”項(xiàng)下檢測(cè)條件，測(cè)定金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿峰面積，計(jì)算得各對(duì)照品平均含量分別為0.5497%、0.2876%、0.0911%、0.1604%、0.5005%，RSD分別為1.21%、1.57%、1.93%、1.89%、0.87%，表明此方法重復(fù)性良好(RSD≤5%)[26]。(5)加樣回收率考察：精密稱取已知含量的荷葉飲片(基準(zhǔn)、S1)粗粉，平行稱取6份，每份約0.5 g，置6個(gè)錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，然后按照“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下方法、色譜檢測(cè)條件分別制備供試品溶液并進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定峰面積后計(jì)算，金絲桃苷、異槲皮苷、O-去甲荷葉堿、紫云英苷、荷葉堿平均加樣回收率分別為98.72%、101.22%、100.82%、101.64%、100.59%，RSD分別為1.19%、0.54%、0.90%、1.06%、0.20%，該方法加樣回收率合格，且符合定量要求(回收率95%～105%；RSD≤3%)[26]。結(jié)果見表4。

表3 荷葉5個(gè)特征代表性成分線性關(guān)系及線性范圍(n=5)

表4 荷葉飲片5個(gè)特征性代表成分加樣回收率考察結(jié)果(n=6)

2.1.6 模擬基準(zhǔn)點(diǎn)質(zhì)量表征考察 選定有效特征指標(biāo)性成分荷葉堿作為質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)。精密稱取4.20 mg荷葉堿對(duì)照品于5 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液，超聲使其溶解后定容至刻度并搖勻，即得濃度為0.840 mg/mL的荷葉堿對(duì)照品母液，精密量取該對(duì)照品母液1 mL于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋，即得濃度為0.084 mg/mL的對(duì)照品溶液作為模擬基準(zhǔn)點(diǎn)，該對(duì)照品溶液與“2.1.2”項(xiàng)下制備的荷葉飲片(S1)供試品溶液中所檢測(cè)的荷葉堿含量相同，按照“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測(cè)，得模擬基準(zhǔn)點(diǎn)的HPLC色譜圖見圖2和表5。

注：11 荷葉堿

表5 荷葉質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)質(zhì)量表征結(jié)果

由表5可知，荷葉堿對(duì)照品(模擬基準(zhǔn)點(diǎn))與飲片(基準(zhǔn))供試品中荷葉堿(實(shí)測(cè)基準(zhǔn)點(diǎn))的保留時(shí)間(min)、峰面積相對(duì)偏差絕對(duì)值均小于3%，二者基本吻合，表明本檢測(cè)方法及其測(cè)定結(jié)果、模擬荷葉質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)的準(zhǔn)確性，即荷葉堿對(duì)照品溶液(0.084 mg/mL)可作為模擬質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)。

2.2 荷葉質(zhì)量表征信息研究

有效基準(zhǔn)特征圖譜中11個(gè)特征峰的保留時(shí)間(min)、峰面積(以100 mg荷葉飲片計(jì))、含量，基于模擬基準(zhǔn)點(diǎn)得到的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積及相對(duì)含量、換算系數(shù)(特征代表性成分的相對(duì)含量與相對(duì)峰面積的比值)結(jié)果見表6。

由表6可知，基于模擬基準(zhǔn)點(diǎn)得到的11個(gè)特征峰及其相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間，5個(gè)特征代表性成分的相對(duì)含量，即為荷葉有效質(zhì)量基準(zhǔn)標(biāo)尺。

表6 荷葉飲片(基準(zhǔn)、S1、以100 mg計(jì))有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息

2.3 荷葉質(zhì)量評(píng)價(jià)及驗(yàn)證

取14批待評(píng)價(jià)的荷葉飲片樣品粗粉，按照“2.1.2”項(xiàng)下的方法分別制備供試品溶液(每個(gè)樣品平行制備3份)，按照“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測(cè)，得到各批飲片質(zhì)量表征信息，同時(shí)實(shí)測(cè)基準(zhǔn)荷葉飲片(S1)有效基準(zhǔn)特征圖譜，以及14批待評(píng)價(jià)荷葉飲片特征性代表性成分(金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、荷葉堿、O-去甲荷葉堿)含量，以驗(yàn)證基于質(zhì)量標(biāo)尺對(duì)荷葉飲片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)具有準(zhǔn)確性。結(jié)果如圖3、4、5、6以及表7所示：

注：1～2、10生物堿類；3～4、9黃酮類；5金絲桃苷；6異槲皮苷；7 O-去甲荷葉堿；8紫云英苷；11荷葉堿

圖4 14批荷葉飲片與基準(zhǔn)(S1)相對(duì)保留時(shí)間

圖5 14批荷葉飲片與基準(zhǔn)(S1)的相對(duì)峰面積

圖6 14批荷葉飲片與基準(zhǔn)(S1)的相對(duì)含量

如圖3、4所示，14批荷葉飲片特征圖譜均含有11個(gè)相同的特征峰，且11個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間與實(shí)測(cè)值相吻合，與基準(zhǔn)標(biāo)尺基本一致。結(jié)果表明：14批樣品均為荷葉飲片，并且驗(yàn)證了本文應(yīng)用基準(zhǔn)標(biāo)尺辨別荷葉飲片真?zhèn)尉哂袦?zhǔn)確性。

通過圖5、6可知所關(guān)注的14批荷葉飲片的質(zhì)量表征信息，綜合考量其特征峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)含量、及其高于基準(zhǔn)標(biāo)尺對(duì)應(yīng)點(diǎn)的數(shù)目、高出的幅度及其所涵蓋的主要化學(xué)類型及所含荷葉堿同類成分，評(píng)估得出S14、S4、S9、S13、S8、S11、S7、S6質(zhì)量較優(yōu)。

由表7可得，換算含量值與實(shí)測(cè)含量值基本一致(均為P>0.05)，此結(jié)果驗(yàn)證了特征代表性成分換算含量結(jié)果及其相對(duì)含量結(jié)果具有準(zhǔn)確性。

綜上所述，得出結(jié)論：可選定荷葉堿對(duì)照品作為模擬基準(zhǔn)點(diǎn)，并以此模擬基準(zhǔn)點(diǎn)為基準(zhǔn)表征有效飲片基準(zhǔn)，所表征的有效飲片基準(zhǔn)質(zhì)量表征信息可作為標(biāo)尺，表征并評(píng)價(jià)待測(cè)飲片的質(zhì)量。

3 討論

筆者對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行考察，考察后得出：70%甲醇溶液60倍量回流提取1次，提取2小時(shí)，效果最佳，可將荷葉飲片中生物堿類和黃酮類成分提取完全，故選用此法制備供試品溶液。

在采用HPLC-PDA法建立荷葉有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法時(shí)分別對(duì)流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，考察后得到最優(yōu)色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-磷酸(0.2%)-三乙胺水(0.4%) ，檢測(cè)波長(zhǎng)為 270 nm。

在對(duì)各特征峰峰面積進(jìn)行質(zhì)量表征時(shí)，峰面積均以100 mg荷葉飲片計(jì)，即，將峰面積換算為每100 mg樣品下各特征峰的峰面積，以消除由于稱樣量不同而帶來的誤差。

本研究以自然藥學(xué)觀藥物體系為導(dǎo)向[27-30]，以降糖有效的荷葉為飲片基準(zhǔn)，選擇其特征指標(biāo)性成分荷葉堿為質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)，以主要化學(xué)類型且具有降糖活性的特征代表性成分(金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、荷葉堿、O-去甲荷葉堿)[31-33]為質(zhì)量考察指標(biāo)，因而所構(gòu)建的基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法充分體現(xiàn)荷葉質(zhì)量的整體性、特征性、有效性；且以荷葉堿對(duì)照品模擬基準(zhǔn)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)，可使得本評(píng)價(jià)方法具有準(zhǔn)確性、便捷性、經(jīng)濟(jì)性和可行性。研究應(yīng)用于對(duì)14批荷葉飲片質(zhì)量?jī)?yōu)良度評(píng)價(jià)： S14、S4、S9、S13、S8、S11、S7、S6樣品質(zhì)量較優(yōu)。本研究以一種新的模式去評(píng)價(jià)荷葉飲片的質(zhì)量，可為荷葉及其制備物質(zhì)量有效精準(zhǔn)評(píng)價(jià)與控制提供方法、模式借鑒。