染色體9p21遺傳變異與中國漢族人群冠心病的關(guān)聯(lián)性

鄭東春，張?zhí)烊冢瑒⒑椴?，陳懷基，?琪，許 峰，張月竹，周麗婷，葉 琳

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長春130021；2. 中國人民解放軍第202醫(yī)院感染控制科，遼寧 沈陽 110003 )

冠心病(coronary heart disease，CHD)是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類生命健康的一種最為常見和多發(fā)的心血管疾病，是多數(shù)發(fā)達(dá)國家和許多發(fā)展中國家成人死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計目前我國冠心病患者有1 100萬[1]。我國急性心肌梗死死亡率總體呈上升趨勢，根據(jù)《2016年中國衛(wèi)生和計劃生育統(tǒng)計年鑒》，2015年中國城市居民冠心病死亡率為110.67/10萬，農(nóng)村居民冠心病死亡率為110.91/10萬[2]。環(huán)境因素和遺傳因素被認(rèn)為在冠心病發(fā)生中起著重要作用，但是目前冠心病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)尚未完全闡明。

全基因組關(guān)聯(lián)研究[3-4]顯示：在染色體9p21區(qū)域存在新的與白種人冠心病相關(guān)聯(lián)的易感位點。之后一些國家的學(xué)者及國際合作研究小組對9p21區(qū)域相關(guān)位點遺傳變異與冠心病的關(guān)系在不同地區(qū)不同人群中開展了驗證試驗[5-11]，得到的研究結(jié)果并不一致。

染色體9p21區(qū)域具有高度連鎖不平衡特性，已報道的與冠心病關(guān)聯(lián)的9p21區(qū)域長度約為100 000 bp，含有大量單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點。本研究以中國東北漢族冠心病患者和健康對照人群為研究對象，對染色體9p21區(qū)域rs2383206和rs2383207位點的多態(tài)性進(jìn)行檢測，探討rs2383206和rs2383207位點遺傳變異與中國人群冠心病的關(guān)系。目前尚無關(guān)于該位點遺傳變異與中國東北漢族人群冠心病的關(guān)聯(lián)性研究。本研究可為冠心病的病因?qū)W研究奠定基礎(chǔ)，并為冠心病的進(jìn)一步預(yù)防和干預(yù)提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象以中國東北漢族冠心病患者和排除冠心病的健康人為研究對象，分成病例組和對照組。病例組為2009—2012年在吉林大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的冠心病患者，共580例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)及心電圖變化均符合1979年WHO制定的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)冠狀動脈造影顯示至少有1支冠狀動脈管腔狹窄≥50%；③個體間無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他心臟疾病如擴張型心肌病和風(fēng)濕性心臟病等；②嚴(yán)重的肝腎疾病；③既往接受靜脈溶栓、冠狀動脈支架植入術(shù)或冠狀動脈旁路移植術(shù)的患者。對照組為同期在吉林大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心體檢健康的無冠心病病史的人群，入組對象均經(jīng)病史詢問、體檢、心電圖檢查和其他血液生化檢查無異常發(fā)現(xiàn)，且以前無冠心病病史，共539人。

經(jīng)知情同意后，通過現(xiàn)場詢問和體檢，結(jié)合復(fù)查病歷和體檢報告，收集所有研究對象的流行病學(xué)資料，并采集空腹抗凝靜脈血5 mL。本研究的所有樣本收集和檢測均經(jīng)吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 基因組DNA提取使用天根DNA提取試劑盒從全血中提取基因組DNA。采用美國BECKMAN公司生產(chǎn)的Du640型紫外分光光度計測定提取DNA 的純度和濃度，以A(260)/A(230)值位于1.8～2.0間，且A(260)/A(230)>2.0為合格樣本。

1.3 位點選擇和引物設(shè)計選擇目前報道的9p21區(qū)域與冠心病強相關(guān)的位點rs2383206和rs2383207為待測位點，采用Assay Designer 3.1軟件進(jìn)行引物擴增、延伸和引物設(shè)計，引物序列見表1。

1.4 基因分型將DNA 樣本稀釋至5 mg·L-1，使用Ex Taq 聚合酶，在384 孔板常規(guī)擴增待測片段(PCR 反應(yīng)條件：94℃、5 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，40個循環(huán)；72℃、3 min)，在PCR 產(chǎn)物中加入2 μL 堿性磷酸酶以除去未用盡的dNTPs(反應(yīng)條件：37℃、60 min，85℃、10 min)。根據(jù)SEQUENOM 程序進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)， 反應(yīng)條件：94℃、15 min；94℃、5 s,(52℃、5 s，80℃、5 s，5個循環(huán)),40個循環(huán)；72°C、3 min。在終止反應(yīng)物中加入6 mg 陽離子交換樹脂脫鹽，混合后補充16 μL蒸餾水。用納升點樣儀將產(chǎn)物分點在質(zhì)譜微陣列芯片上。在Typer 4.0操作程序中編輯相對應(yīng)的引物和樣本，并按順序讀取相對應(yīng)的SNPs 分型數(shù)據(jù)。

表1 rs2383206和rs2383207位點擴增引物及延伸引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用χ2檢驗分析病例組和對照組受試者性別、吸煙、飲酒、高血壓病史、糖尿病史和基因頻數(shù)分布差異；病例組和對照組受試者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)正態(tài)性檢驗結(jié)果均呈正態(tài)分布，故組間比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 2組受試者基本情況病例組和對照組受試者性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。病例組冠心病患者吸煙、高血壓病史和糖尿病史所占比例明顯高于對照組人群(P<0.01)，WHR、SBP、DBP和TC水平也明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 病例組和對照組受試者基本情況

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗對照組和病例組受試者染色體9p21上rs2383206和rs2383207位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明本研究人群為隨機婚配的自然群體。見表3。

表3 基因型頻數(shù)分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.3 2組受試者SNPs 位點基因型頻數(shù)分布病例組和對照組人群中rs2383206位點的基因型分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);病例組和對照組人群中rs2383207位點基因型頻數(shù)分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中AA基因型在病例組頻數(shù)(8.3%)分布明顯低于對照組(13.6%)。見表4。

3 討 論

冠心病是由環(huán)境危險因素和遺傳因素共同作用的一種多基因遺傳疾病。以往的研究[12-15]表明：高血壓、吸煙、血脂異常、肥胖與超重、血糖異常、不良飲食習(xí)慣、精神壓力和自然環(huán)境的改變等是冠心病的危險因素。本研究結(jié)果顯示：2組受試者吸煙、WHR、高血壓病史、糖尿病史、SBP、DBP和TC水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，病例組人群中吸煙、有高血壓病史和糖尿病病史患者所占的百分比明顯高于對照組，且WHR、SBP、DBP和TC水平也明顯高于對照組。本研究結(jié)果表明：吸煙、WHR、高血壓病史、糖尿病史、SBP、DBP和TC水平均是冠心病的危險因素。

表4 SNPs 位點基因型頻數(shù)分布及其與冠心病的關(guān)系

9p21區(qū)域的遺傳變異與冠心病發(fā)生有關(guān)，9p21區(qū)域已成為研究冠心病遺傳學(xué)病因的熱點區(qū)域。我國的很多學(xué)者也在中國漢族人群中對此進(jìn)行了驗證和探討，得到的結(jié)論并不完全一致。田朝偉[8]和周莉[10]的研究結(jié)果表明：rs2383206位點可能不是中國漢族人群冠心病的易感位點；而張琦等[9]、Lv等[7]和Ding等[6]的研究結(jié)果表明：rs2383206位點是中國漢族人群冠心病的易感位點。本研究結(jié)果顯示：rs2383206位點的基因型在病例組和對照組人群中分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是AA基因型在病例組中的頻數(shù)分布低于對照組。本研究結(jié)果還顯示：rs2383207位點的基因型在病例組和對照組人群中頻數(shù)分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中病例組患者AA基因型頻數(shù)(8.3%)分布明顯低于對照組(13.6%)，表明rs2383207位點AA基因型可能是冠心病的保護基因型。

染色體9p21 區(qū)域中包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的編碼序列CDKN2A 和CDKN2B，與動脈粥樣硬化關(guān)系密切[16]。近年來有些研究[17-20]提示：9p21 區(qū)域CDKN2A 和CDKN2B 基因的編碼序列與2 型糖尿病和中風(fēng)等疾病也存在著一定的關(guān)聯(lián)，表明9p21 區(qū)域在多種復(fù)雜疾病過程中可能發(fā)揮很大的作用。進(jìn)一步的研究應(yīng)集中在染色體9p21區(qū)域影響冠心病等疾病發(fā)病的機制上。

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