當(dāng)歸多糖對青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

齊 若，周曉利，顧志敏，霍銀平

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院眼科，河南 鄭州 450052)

青光眼是以視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷為特征的眼科多發(fā)疾病，是導(dǎo)致視功能嚴(yán)重受損的重要原因，眼壓升高是其主要的危險因素，目前尚不清楚其具體致病機(jī)制[1]。臨床治療以降低眼壓和保護(hù)視神經(jīng)為主。眼壓升高可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷，造成視功能減退，引起一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[2]。近年來研究[3-5]顯示：眼壓升高引起神經(jīng)毒素因子一氧化氮(NO)和自由基的大量釋放，通過與超氧自由基再結(jié)合，產(chǎn)生出毒性更大的羥基自由基，直接或間接造成視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡。研究[6-8]證明：在視神經(jīng)損傷過程中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)介導(dǎo)蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，降低Caspase-3可改善活體感光細(xì)胞光損傷程度及保證視網(wǎng)膜細(xì)胞存活。隨著研究的深入，治療青光眼的根本環(huán)節(jié)是保護(hù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞，減少節(jié)細(xì)胞的不斷丟失[9-10]。

中醫(yī)對視神經(jīng)保護(hù)具有獨(dú)特優(yōu)勢，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量中藥對視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究。當(dāng)歸多糖是植物當(dāng)歸的主要藥理成分，現(xiàn)代藥理研究[11-12]表明：當(dāng)歸多糖能增加機(jī)體的免疫功能，能夠清除活性氧自由基并且具有極強(qiáng)的抗氧化能力。目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報道。當(dāng)歸多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用，基于此，本文作者通過動物實(shí)驗(yàn)觀察當(dāng)歸多糖對青光眼致模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，探討其抗氧化損傷的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究當(dāng)歸多糖保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥物、主要試劑和儀器SPF級、健康雄性SD大鼠84只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SYXK(陜)2014-001。當(dāng)歸多糖(糖含量85.1%，自制)，維生素E滴丸(廣東中山市三才醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Caspase-3、GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體(美國Sigma公司)。CX7型全自動生化檢測儀(美國 Beakman公司)，Blofuge28RS型高速冷凍離心機(jī)(德國賀利氏集團(tuán)公司)，F(xiàn)LUOR plus型多功能酶標(biāo)儀(瑞典Tecan公司)，Stepone Plus型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，AEL-160電子分析天平(日本島津公司)。

1.2 青光眼大鼠模型制備及分組將84只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥組、低劑量當(dāng)歸多糖組、中劑量當(dāng)歸多糖組和高劑量當(dāng)歸多糖組，每組14只。參照參考文獻(xiàn)[13]，除對照組外，其余4組大鼠采用燒灼烙閉鞏膜上靜脈法建立大鼠青光眼模型。10 d后，大鼠平均眼壓維持在22 mmHg以上者為造模成功。低、中和高劑量當(dāng)歸多糖組大鼠每日分別灌胃給予0.3 mL當(dāng)歸多糖溶液(12、24和48 g·L-1)，陽性藥組大鼠按成動物給藥劑量灌胃維生素E溶液(0.2 g·d-1)，對照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水。連續(xù)給藥2周。

1.3 各組大鼠眼壓測定分別于造模后3、5、7、10和14 d，用筆式眼壓計測量各組大鼠眼壓，測量前用丁卡因藥水滴雙眼，取其平均值，測量結(jié)束后用藥水沖洗大鼠眼結(jié)膜囊。

1.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性及MDA和NO水平給藥2周后，脫頸處死大鼠，摘取眼球，顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜后稱質(zhì)量，加9倍預(yù)冷生理鹽水，低溫條件下，以3 000 r·min-1離心20 min，取上清液，按試劑盒操作說明，采用比色法測定大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性及MDA和NO水平。

1.5 RT-PCR法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 mRNA表達(dá)水平按照 Trizol 試劑盒操作步驟提取大鼠視網(wǎng)膜組織總RNA，紫外分光光度計法測定總 RNA 含量，采用 RT-PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，采用凝膠圖像計算光密度積分，進(jìn)行半定量分析，計算Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平。引物序列：Caspase-3， 上游引物5′-AGAGCTGCACTGCGGTATTGAG-3′，下游引物5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′；GAPDH，上游引物5′-ATCTTCCAGGAGCGAGAT-3′，下游引物5′-TAAGCAGTTGGTGGTGCA-3′。

1.6 Western bloting法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平給藥2周后，剝?nèi)〈笫笠暰W(wǎng)膜組織，粉碎，加入組織裂解液提取蛋白，用Western blotting試劑盒進(jìn)行蛋白定量，采用濕轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式，加入兔抗鼠抗體Caspase-3過夜，山羊抗兔抗體孵育90 mim，每組取10 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到的條帶用凝膠成像分析儀進(jìn)行分析，計算視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 蛋白相對表達(dá)水平，蛋白表達(dá)水平=目的蛋白吸光度(A)值/內(nèi)參蛋白A值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠眼壓與對照組比較，模型組大鼠各時間點(diǎn)眼壓明顯升高(P<0.05)，青光眼模型制備成功；與模型組比較，陽性藥組及低、中和高劑量當(dāng)歸多糖組大鼠眼壓明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。7 d以后，與低劑量當(dāng)歸多糖組和陽性藥組比較，高劑量當(dāng)歸多糖組大鼠眼壓明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)眼壓

Tab.1 Intraocular pressures of rats in various groups at different time points

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)眼壓

GroupIntraocularpressure(t/d) 3571014Control13．61±0．8313．94±0．7513．87±0．9313．52±0．7513．88±0．73Model21．44±0．79?25．38±1．05?28．72±1．11?30．48±1．06?31．51±1．20?Positivedrug20．22±1．1320．67±1．81△19．83±1．21△19．54±1．37△17．55±0．98△Angelicapolysaccharide Lowdose20．18±1．2120．46±1．34△21．48±0．86△19．01±0．54△18．20±0．66△ Middledose19．46±0．9818．61±1．64△19．27±0．91△17．63±0．81△15．43±0．79△ Highdose19．01±1．1318．13±0．87△18．44±1．02△#○15．44±0．97△#○15．61±0．91△#○

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group；#P<0.05 compared with low dose of Angelica polysaccharide group;○P<0.05 compared with positive drug group.

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性及MDA和NO水平與對照組比較，SOD活性明顯降低(P<0.05)，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中MDA和NO水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組及低、中和高劑量當(dāng)歸多糖組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA和NO水平均明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。與低劑量當(dāng)歸多糖組比較，高劑量當(dāng)歸多糖組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA和NO水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組及低、中和高劑量當(dāng)歸多糖組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與低劑量當(dāng)歸多糖組比較，高劑量當(dāng)歸多糖組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表3和圖1。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性及MDA和NO水平

Tab.2 Activities of SOD and levels of MDA and NO in retina tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性及MDA和NO水平

GroupSOD[λB/(U·L-1)]MDA[cB/(μmol·L-1)]NO[cB/(μmol·L-1)]Control151．74±17．264．56±0．7913．13±1．67Model107．60±12．54?7．47±0．84?34．75±2．51?Positivedrug140．27±11．81△5．01±0．92△15．44±1．40△Angelicapolysaccharide Lowdose133．23±11．39△5．88±0．66△15．67±1．04△ Middledose148．35±13．67△4．43±0．87△13．52±1．36△ Middledose156．27±11．98△#4．39±0．61△#12．89±1．11△#

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group；#P<0.05 compared with low dose of Angelica polysaccharide group.

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 mRNA水平

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05 compared with model group；#P<0.05 compared with low dose of Angelica polysaccharide group.

Lane 1：Control group； Lane 2：Model group；Lane 3:Low dose of Angelica polysaccharide group；Lane 4：Middle dose of Angelica polysaccharide group；Lane 5：High dose of Angelica polysaccharide group;Lane 6：Prositive drug group.

3 討 論

青光眼是以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為特征的疾病，眼壓升高是其主要危險因素[14]。當(dāng)歸是我國傳統(tǒng)常用“補(bǔ)血”中藥，為傘形科植物當(dāng)歸干燥根，性溫，味甘、辛，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、抗氧化、抗炎和增強(qiáng)免疫等功效，為最常用的無毒上品藥物[15]。當(dāng)歸多糖為當(dāng)歸水溶性提取物，主要由葡萄糖和半乳糖組成，現(xiàn)代藥理研究[16]表明：當(dāng)歸多糖可促進(jìn)造血功能，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。本研究觀察當(dāng)歸多糖對青光眼模型大鼠保護(hù)作用的結(jié)果顯示：當(dāng)歸多糖作用于青光眼大鼠2周后，大鼠眼壓明顯降低，提示當(dāng)歸多糖對青光眼大鼠眼壓具有明顯的改善作用。

研究[17-18]表明：青光眼患者視網(wǎng)膜組織中脂質(zhì)過氧化升高，而抗氧化酶活性降低。MDA是膜過氧化產(chǎn)物之一，SOD是主要抗氧化酶。因此通過檢測視網(wǎng)膜組織中MDA水平可以反映視網(wǎng)膜組織中脂質(zhì)過氧化水平，反映出視網(wǎng)膜組織自由基損傷程度。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)不同劑量當(dāng)歸多糖作用后，大鼠視網(wǎng)膜組織中MDA水平明顯降低，而SOD活性較模型組明顯升高，提示當(dāng)歸多糖通過降低MDA水平，提高抗氧化酶活性，降低自由基含量，從而減輕青光眼大鼠視網(wǎng)膜組織過氧化水平及自由基氧化損傷，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。

NO廣泛存在于體內(nèi)，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷中，NO的毒性作用可能是細(xì)胞毒性作用，其通過與超氧自由基再結(jié)合，產(chǎn)生毒性更大的羥基自由基，直接或間接地造成視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡。NO屬自由基結(jié)構(gòu)，是一種非傳統(tǒng)的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)。研究[20]證明：NO由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，過量的NO有潛在的神經(jīng)毒性，可存在于突觸間隙，刺激谷氨酸鹽的釋放，對青光眼神經(jīng)破壞起主要作用。研究[21]顯示：NO還可以破壞DNA的螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞損害，還可以與某些鐵原子結(jié)合形成亞硝酰鐵螯合結(jié)構(gòu)，抑制與細(xì)胞呼吸有關(guān)的關(guān)鍵酶的活性，加重神經(jīng)元破壞。Caspase-3作為凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，存在于細(xì)胞內(nèi)，受上游蛋白酶影響。研究[22]證實(shí)：Caspase-3在視神經(jīng)損傷病理過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示：給予當(dāng)歸多糖后青光眼大鼠視網(wǎng)膜組織中NO水平及Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，肯定了當(dāng)歸多糖在青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用，可能與當(dāng)歸多糖抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷后Caspase-3表達(dá)及減少視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，當(dāng)歸多糖還具備抗氧化效應(yīng)，可減少視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞組織的耗氧量，快速清除NO，阻斷NO合成， 減輕青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，當(dāng)歸多糖對青光眼模型大鼠的視網(wǎng)膜組織有保護(hù)作用，可以降低視網(wǎng)膜組織中MDA和NO水平，升高SOD活性，同時降低視網(wǎng)膜組織中Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平，這可能是當(dāng)歸多糖保護(hù)視網(wǎng)膜組織神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制之一，但其相互調(diào)控關(guān)系仍需進(jìn)一步深入研究。本研究為臨床開發(fā)當(dāng)歸多糖防治青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 張 誠，張殷建. 青光眼視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外源性凋亡機(jī)制及中西醫(yī)保護(hù)研究新進(jìn)展 [J].西部中醫(yī)藥，2017，30(1)：134-138.

[2] 劉曉坤，張曉宇，王 赟，等.米諾環(huán)素對大鼠視神經(jīng)挫傷后視網(wǎng)膜Caspase-3表達(dá)的影響[J].眼科新進(jìn)展，2013，33(12)：1132-1135.

[3] Nishikawa Y，Oku H，Morishita S，et al.Negative impact of AQP-4 channel inhibition on survival of retinal ganglion cells and glutamate metabolism after crushing optic nerve [J].Exp Eye Res，2016，146：118-127.

[4] Sánchez-Migallón MC， Valiente-Soriano FJ， Nadal-Nicolás FM，et al. Apoptotic retinal ganglion cell death after optic nerve transection or crush in mice:delayed RGC loss with BDNF or a caspase 3 inhibitor [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2016，57(1)：81-93.

[5] 劉 恬，劉奕志，鐘惟德，等.色素上皮衍生因子對晶狀體上皮細(xì)胞生長的促進(jìn)作用及其機(jī)制 [J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2015，33(4)：342-346.

[6] 何家全，楊 忠，蔡文琴，等.大鼠視神經(jīng)的發(fā)育學(xué)研究[J].西部醫(yī)學(xué)，2015，27(4)：486-489.

[7] Lossi L，Cocito C，Alasia S，et al.Ex vivo imaging of active caspase 3 by a FRET-based molecular probe demonstrates the cellular dynamics and localization of the protease in cerebellar granule cells and its regulation by the apoptosis-inhibiting protein survivin [J].Mol Neurodegener，2016，11(4)：34.

[8] Shiri R，Yari F，Ahmadinejad M，et al.The caspase-3 inhibitor (peptide Z-DEVD-FMK) affects the survival and function of platelets in platelet concentrate during storage [J].Blood Res，2014，49(1)：49-53.

[9] Noristani R，Kuehn S，Stute G，et al.Retinal and optic nerve damage is associated with early glial responses in an experimental autoimmune glaucoma model [J].J Mol Neurosci，2016，58(4)：470-482.

[10]Bell K，Wilding C，F(xiàn)unke S，et al.Neuroprotective effects of antibodies on retinal ganglion cells in an adolescent retina organ culture [J].J Neurochem，2016，139(2)：256-269.

[11]李貴榮,呂昌銀，楊勝圓．當(dāng)歸多糖清除活性氧自由基作用的研究 [J].南華大學(xué)學(xué)報：理工版，2002，16(3)：18-20.

[12]劉麗花．當(dāng)歸多糖抗氧化作用的研究[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢,2014,12(3):284-285.

[13]Park KH,Cozier F,Ong OC,et al.Induction of heat shock protein 72 protects retinal ganglion cells in a rat glaucoma model [J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42(7)：1522-1530.

[14]Tham YC，Aung T，F(xiàn)an Q，et al.Joint effects of intraocular pressure and myopia on risk of primary open-angle glaucoma:The singapore epidemiology of eye diseases study [J].Sci Rep，2016，6：19320.

[15]馮學(xué)花，梁肖蕾.當(dāng)歸化學(xué)成分與藥理作用的研究進(jìn)展 [J].廣州化工，2012，40(22)：16-18.

[16]曹 蔚.當(dāng)歸多糖的結(jié)構(gòu)與抗腫瘤作用及其機(jī)制研究 [D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2006.

[17]馬 園，王大朋，許熙國，等.活性氧、丙二醛及超氧化物歧化酶在NaAsO2致人角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的動態(tài)變化 [J].衛(wèi)生研究，2015，44(3)：456-561.

[18]施月歡，鄒秀蘭，趙松濱.川芎嗪對大鼠缺血再灌注視網(wǎng)膜 SOD、MDA和NO水平及細(xì)胞凋亡的影響 [J].眼科研究，2001，19(4)：301-303.

[19]Ho MF,Low LM,Rose’Meyer RB.Pharmacology of the adenosine A3 receptor in the vasculature and essential hypertension [J].PLoS One,2016,11(2)：e0150021.

[20]Estíbaliz GF，María Victoria SG，Alberto PS，et al．A3 adenosine receptors mediate oligodendrocyte death and ischemic damage to optic nerve [J].Glia，2014，62(2)：199-216.

[21]王 爽，梁申芝，萬光明，等.高度近視對糖尿病豚鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子和色素上皮衍生因子表達(dá)的影響 [J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2014，32(5)：398-402.

[22]林 琳，買買江·阿不力孜，張永輝，等.視神經(jīng)減壓術(shù)干預(yù)兔視神經(jīng)損傷模型視網(wǎng)膜 Caspase-3變化 [J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2016，15(1)：82-84.