蕎麥花葉發(fā)酵提取物對(duì)2型糖尿病db/db小鼠腎損傷的影響

王建行，姜 妍，王 妍，吳 磊，穆 玉，韓淑英

(1.華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院教學(xué)管理部，河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 唐山 063000； 4.河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

糖尿病腎損傷是一種糖尿病病程中最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，是糖尿病全身性微血管病變表現(xiàn)之一，其以腎小球?yàn)V過(guò)率降低、腎小球外基質(zhì)堆積和腎小球纖維化為主要病理特征[1]，持續(xù)發(fā)展可致終末期腎功能衰竭[2]。近年來(lái)隨著糖尿病患者的增多，糖尿病腎損傷的發(fā)病率亦逐年上升，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

前期研究[3-6]顯示：從蕎麥花葉中提取的黃酮具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗、改善微循環(huán)、抗氧化和抗炎等作用，并對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用。近期對(duì)蕎麥花葉進(jìn)行酵母菌發(fā)酵處理，發(fā)現(xiàn)其黃酮含量有所降低[7]，表明微生物發(fā)酵后成分有所改變，且其發(fā)酵后的提取物可顯著降低db/db小鼠隨機(jī)血糖[8]，并對(duì)db/db小鼠腎組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothetial growth factor,VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表達(dá)有明顯的影響[9]，但其對(duì)腎臟的作用尚未明確。本實(shí)驗(yàn)是在前期研究的基礎(chǔ)上，研究蕎麥花葉發(fā)酵提取物(extract from fermented buckwheat flower and leaf，EFBFL)對(duì)自發(fā)肥胖2型糖尿病db/db小鼠的腎臟損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品、試劑和主要儀器8周齡SPF級(jí)db/db、db/m小鼠，雄性，體質(zhì)量(35±5)g，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2001-0003。蕎麥花葉：內(nèi)蒙古通遼市庫(kù)倫旗。EFBFL的制備：將活化增殖的酵母菌液加入干燥的蕎麥花葉粉末中，給予蛋白胨和葡萄糖營(yíng)養(yǎng)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，用70%乙醇回流提取2 h，離心取上清液，合并濾液，70℃濃縮干燥，即得EFBFL。小鼠過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)單克隆抗體(貨號(hào)：sc-7273)和小鼠核因子κB(NK-κB)單克隆抗體(貨號(hào)：sc-372，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology. Inc)，Western blotting用兔抗鼠多抗(貨號(hào)：ab150073，美國(guó)Abcam公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國(guó) Media Cybernetics 公司)，真彩病理圖像分析系統(tǒng)(型號(hào)HMIAS-2000，高騰科技有限公司)，MV-Ⅱ型雙垂直板式電泳槽(大連競(jìng)邁生物科技有限公司) ，凝膠成像分析系統(tǒng)(Universal Hood Ⅲ，美國(guó)伯樂(lè)公司)，全自動(dòng)生化分析儀(Cobas-8000，德國(guó)羅氏制藥有限公司)，BX-53型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，日立H-7650透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥db/db小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，剪尾法取血，用血糖儀測(cè)定隨機(jī)血糖，篩選出隨機(jī)血糖(RBG)≥16.7 mmol·L-1的實(shí)驗(yàn)用鼠30只，再按體質(zhì)量、血糖分層，隨機(jī)分為3組，每組10只。模型組：灌胃蒸餾水；低和高劑量EFBFL組：分別灌胃低、高劑量EFBFL(50和100 mg·kg-1EFBFL)；另設(shè)db/m小鼠為正常對(duì)照組：灌胃蒸餾水。各組小鼠均每天灌胃1次，連續(xù)給藥8周。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)分別于給藥前和給藥8周末尾靜脈取血用血糖儀測(cè)定小鼠血空腹血糖(FBG)；各組小鼠禁食12 h，摘眼球取血，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中血肌酐(SCr) 和尿素氮(BUN)的水平。小鼠處死后立即對(duì)其進(jìn)行解剖，迅速摘取兩側(cè)腎臟，去除表面被膜，經(jīng)生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱質(zhì)量，一部分置于2%戊二醛溶液保存，一部分置于4%多聚甲醛溶液固定；計(jì)算腎臟指數(shù)，腎臟指數(shù)=雙腎平均腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4 光鏡和電鏡下觀察小鼠腎組織形態(tài)表現(xiàn)4%多聚甲醛溶液固定小鼠腎臟組織，沖水，梯度酒精脫水、二甲苯溶液透明，浸蠟、包埋、切片，HE染色及Masson 染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)表現(xiàn)和腎組織纖維化程度。4%戊二醛溶液固定腎臟組織，采用透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠腎組織PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)水平石蠟包埋的腎組織連續(xù)切片(5 μm)，經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)后，加1∶100稀釋的一抗4℃過(guò)夜，PBS洗3次，加二抗37℃、60 min，PBS洗3次， DAB顯色，自來(lái)水終止顯色，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS 替代一抗作為陰性對(duì)照，在光鏡下觀察PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)及分布(細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性信號(hào))。將每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，用 Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)檢測(cè)PPARγ和NF-κB的平均積分吸光度(IA)值。

1.6 Western blotting法檢測(cè)小鼠腎組織PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)水平取腎組織在裂解液中制成勻漿，離心后取上清液，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。上樣前加入5×buffer，100 μg蛋白樣品經(jīng)電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h后，孵育一抗PPARγ(1∶500)、NF-κB(1∶1 000)4℃緩慢振蕩過(guò)夜。次日TBST漂洗濾膜5 min×3次，孵育二抗Goat anti-Rabbit IgG/HRP(1∶5 000)稀釋，37℃室溫振蕩孵育1 h，TBST漂洗5 min×3次，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，暗室曝光。采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果用目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 給藥前后各組小鼠FBG水平給藥前后正常對(duì)照組小鼠FBG水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；與正常組比較，給藥前模型組及EFBFL組小鼠FBG水平明顯升高(P<0.05)；給藥8周后，與模型組比較， EFBFL組小鼠FBG水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，尤以高劑量EFBFL組效果最為明顯。見(jiàn)表1。

表1 給藥前后各組小鼠FBG水平

*P<0.05vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.2 各組小鼠腎功能指標(biāo)與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中的SCr和BUN水平明顯升高(P<0.05)，腎臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較， 高劑量EFBFL組小鼠血清中的SCr和BUN水平明顯降低(P<0.05)，低劑量EFBFL組小鼠血清中的SCr和BUN水平降低不明顯(P>0.05)；與模型組比較，高劑量EFBFL組小鼠腎臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)，低劑量EFBFL組小鼠腎臟指數(shù)升高不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腎功能指標(biāo)

Tab.2 Indexes of kidney function of mice in various groups

表2 各組小鼠腎功能指標(biāo)

GroupSCr[cB/(μmol·L-1)]BUN[cB/(mmol·L-1)]KidneyindexNormalcontrol20．71±4．526．68±1．811．09±0．09Model25．92±5．01?8．70±1．27?0．67±0．05??EFBFL Lowdose24．03±4．237．61±1．680．75±0．08?? Highdose21．25±3．54△7．00±1．29△0．87±0．07??△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.3 各組小鼠腎組織形態(tài)表現(xiàn)給藥8周后，正常對(duì)照組小鼠腎組織中腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織中腎小球固縮明顯，囊腔增大，部分腎小球系膜增生、基底膜增厚，腎間質(zhì)散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)及出血點(diǎn)，腎小管細(xì)胞水腫明顯；與模型組比較，EFBFL組小鼠上述病理改變均有不同程度減輕，高劑量EFBFL組小鼠腎損傷程度明顯減輕。見(jiàn)圖1(插頁(yè)四)。

2.4 各組小鼠腎組織纖維化程度給藥8周后，正常對(duì)照組小鼠腎組織中腎小球清晰，大小正常，可見(jiàn)少量藍(lán)染物質(zhì)，纖維化程度極低；與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織中腎小球系膜基質(zhì)和腎間質(zhì)見(jiàn)大量藍(lán)染物質(zhì)沉積，組織纖維化明顯；與模型組比較，EFBFL組小鼠腎組織藍(lán)染物質(zhì)明顯減少，纖維化程度均有不同程度降低。見(jiàn)圖2(插頁(yè)四)。

2.5 各組小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)電鏡下觀察，正常對(duì)照組小鼠腎組織中腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小球基底膜厚度均勻，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，足突分布均勻、排列整齊清晰，無(wú)融合現(xiàn)象；與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織中腎小球基底膜彌漫性增厚，足細(xì)胞數(shù)量減少，足突增寬、融合甚至消失。與模型組比較，EFBFL組小鼠腎組織上述現(xiàn)象有不同程度改善。見(jiàn)圖3。

A： Normal control group； B： Model group；C：Low dose of EFBFL group；D：High dose of EFBFL group.

2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠腎組織中PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)水平正常對(duì)照組小鼠腎組織中PPARγ主要位于腎小球，陽(yáng)性表達(dá)蛋白染色呈棕色；模型組小鼠腎組織中PPARγ呈低表達(dá)，陽(yáng)性染色顆粒數(shù)量減少，分布不均勻，顏色呈淺黃色； EFBFL組小鼠腎組織中PPARγ表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性染色顆粒數(shù)量較模型組明顯增多，顏色明顯加深，其中高劑量EFBFL組增強(qiáng)最為明顯(圖4，見(jiàn)插頁(yè)四)。模型組小鼠腎組織中NF-κB表達(dá)于腎小管， 高劑量EFBFL組與正常對(duì)照組NF-κB表達(dá)相當(dāng)，僅有少量表達(dá)(圖5，見(jiàn)插頁(yè)四)。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織中PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較， EFBFL組小鼠腎組織中PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，其中高劑量EFBFL組PPARγ蛋白表達(dá)水平最高，且與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，EFBFL組小鼠腎組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，且高劑量EFBFL組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腎組織中PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)水平

*P<0.05vsnormal control group;△P<0.05vsmodel group.

2.7 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠腎組織中PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織中PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較， EFBFL組小鼠腎組織中PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，高劑量EFBFL組效果最為明顯，且高劑量EFBFL組小鼠腎組織中PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致。見(jiàn)圖6。

3 討 論

糖尿病腎損傷是一個(gè)由高血糖啟動(dòng)的、多因素共同參與的漸進(jìn)性腎臟損傷過(guò)程。高血糖作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，是糖尿病微血管病變發(fā)生和發(fā)展的始動(dòng)因素[10]。已有研究[11]表明：db/db 小鼠處于高血糖狀態(tài)，易發(fā)生腎臟病變，表現(xiàn)為尿蛋白增高、系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增加和基底膜增厚等腎臟結(jié)構(gòu)破壞，隨著高血糖進(jìn)展，腎臟病變進(jìn)一步惡化。db/db 小鼠與2型糖尿病患者有類似的腎臟病變，本研究采用db/db 小鼠作為研究對(duì)象可以較好模擬2型糖尿病腎損傷的特征[12]。本研究結(jié)果顯示：db/db小鼠給予EFBFL治療后，與模型組比較，其血糖、腎臟組織學(xué)病變和腎功能均有不同程度改善，表明EFBFL可在一定程度上減輕小鼠腎損傷，且有一定的降血糖功能，提示EFBFL對(duì)高血糖引起的腎臟疾病具有一定的治療作用。

n=3,±s;*P<0.05,**P<0.01 vs normal control group; △P<0.05,△△P<0.01 vs model group.

隨著對(duì)糖尿病腎損傷的深入研究，其被認(rèn)為是與先天免疫有關(guān)的慢性炎癥疾病。糖尿病患者的長(zhǎng)期高血糖環(huán)境，可促使機(jī)體促炎因子及炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生，攻擊腎臟組織并加重糖尿病腎損傷發(fā)生[13]。糖尿病腎損傷患者微炎癥狀態(tài)與腎功能損傷程度直接相關(guān)。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome pro-liferator-activated receptors,PPARs) 是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，其亞型之一PPARγ在降低血糖、調(diào)節(jié)脂類代謝和抗炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-15]。NF-κB是調(diào)控機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，阻斷NF-κB通路具有多重的抗炎作用。進(jìn)一步的研究[16]表明：PPARγ-NF-κB途徑是調(diào)控炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要的靶點(diǎn)，PPARγ通過(guò)降低NF-κB的活性或抑制其活化，可以下調(diào)炎癥基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥通路，最終緩解炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，EFBFL可明顯升高db/db小鼠腎臟組織中PPARγ的蛋白表達(dá)水平，下調(diào)NF-кB蛋白表達(dá)水平，表明EFBFL通過(guò)激活PPARγ減少NF-кB的轉(zhuǎn)錄活性，減少淋巴細(xì)胞產(chǎn)生促炎分子，促進(jìn)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗炎癥分子，改善炎癥反應(yīng)，減輕腎功能的損傷，延緩腎損傷的進(jìn)展。與此同時(shí)， EFBFL在一定程度上可激活PPARγ信號(hào)通路，從而降低血糖，增加腎臟組織胰島素敏感性，改善腎臟糖代謝異常，抑制腎臟損傷。

綜上所述，EFBFL可降低db/db小鼠血糖，改善腎組織的損害程度，減緩糖尿病的癥狀。其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)PPARγ-NF-κB這一重要靶點(diǎn)，改善炎癥反應(yīng)及腎臟功能；與此同時(shí)，EFBFL能增加小鼠腎臟組織內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)，降低血糖，增加腎臟組織對(duì)胰島素的敏感性，對(duì)腎臟起到一定的保護(hù)作用。本研究為蕎麥花葉的深入研究提供了新的思路，為蕎麥花葉的開(kāi)發(fā)再利用提供了新的研究方向。

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