三重靶向介導(dǎo)的Smac過表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡和周期進(jìn)程的影響

齊亞莉，劉 揚(yáng)，梁 碩，龔守良，王志成，劉威武,3

(1.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，吉林 吉林 132011；2. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130021; 3. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長春 130041)

腫瘤基因-放射治療是治療乳腺癌的主要手段，具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。如何增強(qiáng)其治療靶向性非常重要，本文作者設(shè)想在腺病毒載體中加入人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)啟動(dòng)子來增強(qiáng)腫瘤感染效率[3]，同時(shí)將缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-response element,HREs)克隆到腺病毒載體中增強(qiáng)乏氧條件下的感染效率[4-5]，早期生長因子(early growth response 1，Egr-1)啟動(dòng)子克隆到靶基因上游增強(qiáng)靶基因的輻射靶向效果[6-7]，實(shí)現(xiàn)三重靶向介導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)基因第二線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡性死亡的比率[8]。目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)的研究報(bào)道?；诖?，本研究探討三重靶向介導(dǎo)的Smac過表達(dá)作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后對細(xì)胞周期和凋亡的影響，為臨床乳腺癌放療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、細(xì)胞系和儀器L15培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒購自南京建成生物設(shè)計(jì)院，HRE序列、內(nèi)切酶和T4連接酶購自上海生工公司，氯化鈷(CoCl2)為美國Sigma公司產(chǎn)品，Smac和β-actin一抗及ECL發(fā)光液為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗為美國Pierce公司產(chǎn)品，Annexin Ⅴ-FITC試劑盒購自南京凱基生物公司。人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，人胚腎HEK293細(xì)胞由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。X射線深部治療機(jī)(Volcano,荷蘭Philips公司)

1.2 條件復(fù)制型腺病毒獲得質(zhì)粒pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K已經(jīng)構(gòu)建完成[9]，pMD19T-Smac質(zhì)粒由郭彩霞博士惠贈(zèng)，HRE序列(5′-TGTCACGTCCTGCACGAC-3′)兩端加入XhoⅠ和SmaⅤ酶切位點(diǎn)，將2條互補(bǔ)鏈進(jìn)行合成。pMD19T-Smac質(zhì)粒和pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K質(zhì)粒分別以XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，分別得到Smac片段和載體片段，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，再將pShuttle-Egr1-Smac-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K質(zhì)粒以XhoⅠ和SmaⅠ酶切，獲得載體片段，將HRE片段連接插入后獲得穿梭載體，經(jīng)電轉(zhuǎn)化后并同源重組形成重組腺病毒質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體2000試劑將其轉(zhuǎn)染到人胚腎HEK293細(xì)胞中，包裝好的條件復(fù)制型腺病毒命名為CRAd.pEgr-1-Smac (CRAd.pE-Smac)，以空病毒(CRAd.p)為對照。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞乏氧和照射處理本實(shí)驗(yàn)設(shè)立對照組、CARd.pE-Smac組、乏氧組和CARd.pE-Smac +乏氧組，并根據(jù)是否進(jìn)行4 Gy照射，每組又分為未照射組和照射組，共8個(gè)實(shí)驗(yàn)組。MDA-MB-231細(xì)胞接種于6和24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞80%～90%融合后，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為5的病毒感染滴度進(jìn)行細(xì)胞感染，以終濃度150 μmol·L-1CoCl2模擬乏氧，乏氧24 h后采用X射線深部治療機(jī)進(jìn)行照射，劑量率為0.287 Gy·min-1。

1.4 Smac蛋白表達(dá)檢測病毒感染、乏氧和照射后12 h，MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)裂解緩沖液RIPA提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每泳道上樣50 μg總蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，硝酸纖維膜濕轉(zhuǎn)后5%脫脂奶粉封閉1 h，β-actin和Smac一抗4℃過夜孵育，TBST洗2次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h。ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，檢測表達(dá)量，并拍照進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率及不同周期細(xì)胞百分率采用AnnexinⅤ-FITC試劑盒(含有PI)雙染和單染，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期百分率。按照每孔3×105個(gè)將MDA-MB-231細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板，染毒和乏氧后進(jìn)行4 Gy的X射線照射，12 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色5～15 min后，上機(jī)檢測，每個(gè)樣品收取1.0×104個(gè)細(xì)胞。CellQuest軟件收集并分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以細(xì)胞百分比表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組MDA-MB-231細(xì)胞中Smac蛋白表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)病毒感染、乏氧和4 Gy照射后6 h，CARd.pE-Smac組和CARd.pE-Smac + 乏氧組細(xì)胞中Smac蛋白表達(dá)水平增加，二者之間基本一致；而CARd.pE-Smac + 4 Gy組、乏氧+ 4 Gy組和CARd.pE-Smac +乏氧+ 4 Gy組中Smac蛋白表達(dá)水平逐漸增加，尤其以CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組Smac蛋白表達(dá)水平最高。見圖1。

2.2 各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率與對照組比較，其他各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與相對應(yīng)的未照射組比較，4 Gy照射后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組升高最為明顯。見表1和圖2。

圖1 Western blotting法檢測乏氧和4 Gy X射線照射后12 h MDA-MB-231細(xì)胞中Smac蛋白表達(dá)電泳圖

表1 乏氧和4 Gy照射后12 h 各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vsCARd.pE-Smac group;#P<0.05vshypoxia group;○P<0.01vsCARd.pE-Smac+hypoxia group.

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分率與對照組比較，CARd.pE-Smac +乏氧組和CARd.pE-Smac+乏氧+ 4 Gy組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.05)，而各組S期細(xì)胞百分率均明顯升高(P<0.05)，且乏氧+4 Gy組和CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組S期細(xì)胞百分率與相對應(yīng)的未照射組比較明顯升高(P<0.05)；除對照+4 Gy組外，其他各組G2/M期細(xì)胞百分率均較對照組明顯增加(P<0.05或P<0.01)，且CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組較CARd.pE-Smac +乏氧組G2/M期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.05)。見表2。

3 討 論

目前，在腫瘤的基因-放射治療研究中，靶基因的選擇及其靶向性是治療效果能否增強(qiáng)的關(guān)鍵，提高靶向性及增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，才能有效地實(shí)現(xiàn)基因治療和放射治療的雙重效應(yīng)。將腺病毒載體進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的改變，使其增強(qiáng)對靶細(xì)胞的感染效率，最終實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞中級聯(lián)的擴(kuò)大效應(yīng)[10-11]。hTERT啟動(dòng)子可介導(dǎo)腺病毒載體增強(qiáng)病毒對腫瘤的感染效率[3]，在本研究中利用hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)條件復(fù)制型腺病毒載體。另外，相關(guān)文獻(xiàn)[6-7,12]證實(shí)：電離輻射能夠介導(dǎo)Egr-1啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，其根本原因是氧自由基作用于Egr-1的6個(gè)血清反應(yīng)元件CarG從而發(fā)揮作用，而實(shí)體瘤內(nèi)乏氧微環(huán)境導(dǎo)致輻射誘導(dǎo)自由基生成減少，影響Egr-1的效率，所以利用乏氧誘導(dǎo)因子反應(yīng)原件HRE可介導(dǎo)乏氧條件下基因表達(dá)的效率[4-5]。在靶基因的選擇上，本研究將Smac作為候選基因，主要是利用了Smac由線粒體釋放入胞漿后，可以通過多種途徑引發(fā)caspase家族的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，Smac與腫瘤關(guān)系密切，可在多種腫瘤組織中檢測到其表達(dá)[13]。研究[8]表明：過表達(dá)Smac基因能夠通過激活腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性，增強(qiáng)治療效果。本研究中Western blotting法檢測結(jié)果顯示：輻射可以誘導(dǎo)乏氧條件下的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中Smac蛋白的高效表達(dá)，大大提高了靶向的效率。

A:Control group;B:CARd.pE-Smac group;C:Hypoxia group;D:CARd.pE-Smac+hypoxia group;E:Control+4 Gy irradiation group;F:CARd.pE-Smac+4 Gy irradiation group;G:Hypoxia+4 Gy irradiation group;H:CARd.pE-Smac+Hypoxia+4 Gy irradiation group.

表2 乏氧和4 Gy照射后6 h各組MDA-MB-231細(xì)胞中不同周期細(xì)胞百分率

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vshypoxia group;#P<0.05vsCARd.pE-Smac+hypoxia group.

凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的重要方式之一，放療時(shí)射線可以直接誘導(dǎo)凋亡，并且能夠?qū)е录?xì)胞周期檢查點(diǎn)的阻滯，這是臨床腫瘤放射治療的基礎(chǔ)。用一定的基因治療策略啟動(dòng)細(xì)胞凋亡從而有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，對腫瘤放療有非常重要的意義[14]。Smac是一種促凋亡因子，近年來應(yīng)用Smac進(jìn)行抗腫瘤研究[15]表明：Smac高表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞凋亡，并增加腫瘤細(xì)胞放化療的敏感性。本研究結(jié)果表明：處于乏氧狀態(tài)的感染CARd.pE-Smac腺病毒的細(xì)胞，給予電離輻射則能誘導(dǎo)其凋亡，實(shí)現(xiàn)了腫瘤基因-放射治療目的的最大化。另外，細(xì)胞凋亡可發(fā)生在細(xì)胞周期不同的時(shí)相，細(xì)胞周期的進(jìn)程與凋亡有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示：病毒、乏氧和輻射以及三者聯(lián)合均可明顯增加S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞百分率，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯，其細(xì)胞的DNA損傷有充分的時(shí)間完成修復(fù)，利于細(xì)胞存活，有利于提高腫瘤細(xì)胞放射治療效果[16]。本實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞G2/M期阻滯，可能增加了細(xì)胞放射敏感性，有利于腫瘤放療。

綜上所述，本研究實(shí)現(xiàn)了腫瘤靶向性，利用了腫瘤的乏氧條件和輻射誘導(dǎo)啟動(dòng)子的啟動(dòng)效應(yīng)，從而增強(qiáng)了目的基因Smac過表達(dá)，對于MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用并誘發(fā)G2/M期阻滯。本研究所設(shè)計(jì)的乳腺癌基因-放射治療綜合方案，既利用了腫瘤乏氧的不利條件來解決乏氧問題，也利用hTERT啟動(dòng)子能夠增強(qiáng)目的基因腫瘤靶向性的作用進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向性，并且利用了Egr-1啟動(dòng)子的輻射誘導(dǎo)特性，充分結(jié)合放療時(shí)有利和不利的情況實(shí)現(xiàn)基因放射治療的利益最大化。本研究為臨床乳腺癌的治療提供了新的思路。

[1] DeSantis C,Siegel R,Bandi P,et al. Breast cancer statistics,2011 [J].CA Cancer J Clin,2011,61(6):409-418.

[2] Lara-Guerra H,Roth JA.Gene therapy for lung cancer [J].Crit Rev Oncog,2016,21(1/2):115-124.

[3] Wang X,Zhou P,Sun X,et al.Modification of the hTERT promoter by heat shock elements enhances the efficiency and specificity of cancer targeted gene therapy [J].Int J Hyperthermia,2016,32(3):244-253.

[4] Okino ST,Chichester CH,Whitlock JP Jr.Hypoxia-inducible mammalian gene expression analyzed in vivo at a TATA-driven promoter and at an initiator-driven promoter [J].J Biol Chem,2004,273(37):23837-23843.

[5] Kwon OJ,Kim PH,Huyn S,et al.A hypoxia- and {alpha}-fetoprotein-dependent oncolytic adenovirus exhibits specific killing of hepatocellular carcinomas [J].Clin Cancer Res,2010,16(24):6071-6082.

[6] Liu LL,Smith MJ,Sun BS,et al.Combined IFN-gamma-endostatin gene therapy and radiotherapy attenuates primary breast tumor growth and lung metastases via enhanced CTL and NK cell activation and attenuated tumor angiogenesis in a murine model [J].Ann Surg Oncol,2009,16(5):1403-1411.

[7] Li Y,Guo C,Wang Z,et al.Enhanced effectes of TRAIL-endostatin-based double-gene-radiotherapy on suppressing growth,promoting apoptosis and inducing cell cycle arrest in vascular endothelial cells [J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2012,32(2):167-172.

[8] Pluta P,Cebula-Obrzut B,Ehemann V,et al.Correlation of Smac/DIABLO protein expression with the clinico-pathological features of breast cancer patients [J].Neoplasma,2011,58(5):430-435.

[9] 王宏芳,吳嘉慧,劉純巖,等.攜帶TRAIL基因的條件復(fù)制型腺病毒載體的構(gòu)建及其輻射誘導(dǎo)表達(dá) [J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2014,40(4):699-704.

[10]Yang SW,Chanda D,Cody JJ,et al.Conditionally replicating adenovirus expressing TIMP2 increases survival in a mouse model of disseminated ovarian cancer [J].PLoS One,2011,6(10):e25131.

[11]Zheng FQ,Xu Y,Yang RJ,et al.Combination effect of oncolytic adenovirus therapy and herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir in hepatic carcinoma animal models [J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(5):617-627.

[12]Senzer N,Mani S,Rosemurgy A,et al.TNFerade biologic,an adenovector with a radiation-inducible promoter,carrying the human tumor necrosis factor alpha gene:a phase Ⅰ study in patients with solid tumors [J].J Clin Oncol,2004,22(4):592-601.

[13]Anguiano-Hernandez YM,Chartier A,Huerta S.Smac/DIABLO and colon cancer [J].Anticancer Agents Med Chem,2007,7(4):467-473.

[14]Ledgerwood EC,Morison IM.Targeting the apoptosome for cancer therapy [J].Clin Cancer Res,2009,15(2):420-424.

[15]Fandy TE,Shankar S,Srivastava RK.Smac/DIABLO enhances the therapeutic potential of chemotherapeutic drugs and irradiation,and sensitizes TRAIL-resistant breast cancer cells [J].Mol Cancer,2008,7:60.

[16]Deplanque G,Céraline J,Mah-Becherel MC,et al.Caffeine and the G2/M block override:a concept resulting from a misleading cell kinetic delay,independent of functional p53 [J].Int J Cancer,2001,94(3):363-369.