Gli1基因在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

楊冬野，焦 洋，檀碧波，杜志堅(jiān)，胡曉杰，劉 飛

(1.河北省人民醫(yī)院普外四科，河北 石家莊 050051；2. 河北省人民醫(yī)院消化二科，河北 石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011)

雖然近幾十年對(duì)胃癌的研究不斷深入并取得了較多成就，但是目前胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，胃癌診治效果也沒有取得突破性進(jìn)展，因此尋找新的調(diào)控胃癌進(jìn)展的基因?qū)ξ赴┑木C合診治有重要意義。研究[1-5]表明：膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(glioma-associated oncogene 1,Gil1)作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲的重要相關(guān)因素，近年來也被證實(shí)在多種人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如非小細(xì)胞肺癌和基底細(xì)胞癌等。有研究[6]表明：特異性抑制Gli1表達(dá)能介導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于Gli1在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制還缺少深入的實(shí)驗(yàn)研究。RNA 干擾(RNA interference,RNAi)進(jìn)行特異性基因表達(dá)抑制的核酸操作技術(shù)，現(xiàn)已成為研究腫瘤基因治療的有力工具[7]。因此，本研究對(duì)Gli1在胃癌組織中的表達(dá)進(jìn)行探討，并利用RNA 干擾技術(shù)以Gli1基因?yàn)榘悬c(diǎn)，研究Gli1對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制，為闡明胃癌進(jìn)展機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年8月—2016年12月于河北省人民醫(yī)院普通外科及河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院普通外科手術(shù)切除、病理證實(shí)的胃癌患者95例，其中男性47例，女性48例，中位年齡66歲，分別選取胃癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣≥3 cm、鏡檢未見癌細(xì)胞)，標(biāo)本于術(shù)中離體后分為2份，一份于液氮速凍，并轉(zhuǎn)入-80℃凍存；另一份于中性甲醛中固定。人胃癌細(xì)胞株MKN28、SGC7901、BGC823和胃上皮細(xì)胞株GES-1購自中科院上海細(xì)胞研究所。CCK-8(日本同仁公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液和胰蛋白酶(美國Gibco公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，兔抗人Gli1、P27、MMP-2、MMP-9及β-actin多克隆抗體(美國Sigma公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉公司。各基因的PCR引物由上海吉瑪技術(shù)公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌MKN28、SGC7901、BGC823細(xì)胞株和胃永生化上皮細(xì)胞株GES-1置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在含5% CO2、37℃條件下恒溫孵育，2～3 d傳代1次。細(xì)胞用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)將生長至60%～70%融合的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液備用。

1.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-qPCR)法檢測胃癌組織、癌旁組織和人胃癌細(xì)胞中Gli1 mRNA表達(dá)水平利用Trizol法提取胃癌組織、癌旁組織和胃癌細(xì)胞中的總RNA，檢測提取的RNA的純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照RT-qPCR試劑盒操作說明書進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)Ct值按照2-△△Ct方法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測Gli1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Gli1蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。Gli1蛋白以細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為染色陽性，計(jì)算陽性表達(dá)率。

1.5 BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Gli1 mRNA表達(dá)水平檢測將轉(zhuǎn)染后的BGC823細(xì)胞分為正常培養(yǎng)的細(xì)胞(對(duì)照組)、轉(zhuǎn)染NS-siRNA細(xì)胞(NS-siRNA組)和轉(zhuǎn)染Gli1-siRNA細(xì)胞(Gli1-siRNA組)，按照RT-qPCR試劑盒操作說明書檢測各組細(xì)胞中Gli1 mRNA表達(dá)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.6 CCK8法檢測細(xì)胞增殖率細(xì)胞分組同上。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，按CCK-8試劑盒說明書加入含有CCK-8的培養(yǎng)基(CCK-8溶液∶培養(yǎng)基=1∶10) 100 μL，37℃孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm處測定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=(給藥孔平均A值/ 對(duì)照孔平均A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移能力細(xì)胞分組同上。消化各組細(xì)胞后，PBS清洗1或2次，含1%BSA無血清1640培養(yǎng)基調(diào)整BGC823細(xì)胞濃度為l×106mL-1，取BGC823細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出小室，濕棉簽擦除上室內(nèi)的BGC823細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下(×400)計(jì)數(shù)穿膜的BGC823細(xì)胞數(shù)目，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移能力。

1.8 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平細(xì)胞分組同上。取1×107個(gè)細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液100 μL裂解。4℃、8 000 r·min-1離心10 min。Bradford法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品,10%十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate，SDS) 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，分別加入稀釋的Gli1、P27、MMP-2和MMP-9一抗，4℃過夜。加入二抗，曝光、顯影、定影。以蛋白條帶的平均吸光度(A)值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中Gli1 mRNA表達(dá)水平和Gli1蛋白陽性表達(dá)率RT-qPCR法和免疫組織化學(xué)法檢測95例胃癌組織和癌旁組織中Gli1基因的表達(dá)。胃癌組織中Gli1 mRNA表達(dá)水平(1.00±0.18)明顯高于癌旁組織(0.43±0.09)(t=27.606,P<0.01)；胃癌組織中Gli1蛋白陽性表達(dá)率(75.79%，72/95)明顯高于癌旁組織(22.11%，21/95)(χ2=54.782，P<0.01)。見圖1(插頁三)。

2.2 不同細(xì)胞中Gli1 mRNA的表達(dá)水平以胃上皮細(xì)胞株GES-1為參照，采用RT-qPCR法檢測Gli1 mRNA在胃癌細(xì)胞株MKN28、SGC7901和BGC823的表達(dá)水平。GES-1、MKN28、SGC7901和BGC823細(xì)胞中Gli1mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.09、2.17±0.23、3.32±0.39和5.57±0.62，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.341,P<0.01)。組間兩兩比較：GES-1與MKN28、GES-1與SGC7901、GES-1與BGC823、MKN28與SGC7901、MKN28與BGC823和SGC7901與BGC823比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。胃癌細(xì)胞株BGC823中Gli1 mRNA表達(dá)最高，故選擇BGC823做后續(xù)研究。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中Gli1 mRNA表達(dá)水平3組細(xì)胞中Gli1 mRNA表達(dá)水平分別為：對(duì)照組100.00%±9.17%，con-siRNA組98.57%±9.53%，Gli1-siRNA組57.28%±6.06%，Gli1-siRNA組 Gli1 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組和con-siRNA組(F=48.322，P<0.01)。

2.4 各組胃癌細(xì)胞增殖率轉(zhuǎn)染后24 h，Gli1-siRNA組細(xì)胞增殖率(62.01%±6.31%)明顯低于對(duì)照組(100.00%±7.97%)和con-siRNA組(88.75%±8.19%)(F=54.428,P<0.01)。

2.5 各組胃癌細(xì)胞遷移能力Gli1-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(63±7)低于對(duì)照組(155±15)和con-siRNA組(151±13)(F=257.788,P<0.01)。

2.6 各組胃癌細(xì)胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平Gli1-siRNA基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，con-siRNA組細(xì)胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與con-siRNA組比較，Gli1-siRNA組P27蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表1和圖2。

表1 各組胃癌細(xì)胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

*P<0.05 compared with con-siRNA group.

Lane 1:Control group;Lane 2:Con-siRNA group;Lane 3:Gli1-siRNA group.

3 討 論

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，治療效果及預(yù)后均不理想，因此探索新的治療方法已成為胃癌治療亟待解決的問題。研究[8]表明：基因治療在癌癥病因治療中發(fā)揮著重要作用。Hedgehog信號(hào)通路自1980年被發(fā)現(xiàn)以來，其作用逐漸被人們認(rèn)識(shí)。作為來自內(nèi)胚層的信號(hào)分子之一，Shh信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、成熟器官形成及形態(tài)維持中扮演重要角色。近年來研究[9-10]顯示：Sonic Hedgehog信號(hào)通路是參與多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要信號(hào)通路之一。Gli1是Hedgehog信號(hào)通路的核心成員，發(fā)揮著通路功能調(diào)節(jié)作用[11]。研究[12]顯示：Gli1在胃癌組織中高表達(dá)。但目前對(duì)Gli1基因是否影響胃癌細(xì)胞的遷移及其機(jī)制仍缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)胃癌組織和癌旁組織中Gli1基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示：Gli1基因在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，提示Gli1基因的異常激活可能參與胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移過程。

本研究又進(jìn)一步在細(xì)胞水平上利用Gli1-siRNA技術(shù)抑制Gli1后觀察胃癌細(xì)胞的增殖和遷移及其可能機(jī)制，結(jié)果顯示：與對(duì)照組和con-siRNA組比較，Gli1-siRNA組細(xì)胞活性受到明顯抑制；Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移，Gli1-siRNA轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少。本研究結(jié)果表明：抑制細(xì)胞中Gli1基因表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞增殖能力和遷移侵襲能力，因此Gli1基因可能成為胃癌潛在的治療靶基因。

為進(jìn)一步探討Gli1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的增殖和遷移作用的可能機(jī)制，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道P27蛋白參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，當(dāng)P27蛋白表達(dá)增加時(shí)，其增殖受到抑制[13]。MMP在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，其中，對(duì)通路中某些節(jié)點(diǎn)(如MMP-2和MMP-9)研究成為目前的研究熱點(diǎn)[14-17]。本研究檢測了Gli1-siRNA轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的變化，本研究結(jié)果顯示：抑制細(xì)胞Gli1表達(dá)后，P27的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，提示抑制Gli1后可通過調(diào)控遷移侵襲相關(guān)因子而發(fā)揮對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用，但其具體的分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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