Tum-5基因?qū)Ω渭?xì)胞癌生長(zhǎng)的抑制作用和對(duì)血管生成的影響

歷 春，關(guān)新剛，王英楠，徐聰睿，蓋曉東

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，因此腫瘤血管生成是實(shí)體瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[1-2]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，腫瘤血管豐富，惡性程度高，發(fā)展迅速，生存率低。因此，尋找特異性抗血管生成的靶點(diǎn)成為提高HCC患者生存率的研究熱點(diǎn)。腫瘤抑素(tumstatin，Tum)屬于血管基底膜Ⅳ型膠原蛋白α3鏈的一部分，是Saus等[3]在20世紀(jì)80年代作為肺-腎出血綜合征的自身抗原而被發(fā)現(xiàn)，具有抗血管生成和抗腫瘤活性。Tum是目前發(fā)現(xiàn)活性最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成抑制因子，可通過(guò)特異性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的合成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞特異性凋亡，使新生血管合成受到抑制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[4-6]。Tum-5片段是Tum抗血管生成的活性片段，位于第54～132位氨基酸之間，具有與全長(zhǎng)Tum相同的抗血管生成活性[7]，且不含肺-腎出血綜合征的抗原表位。

本課題組前期研究人Tum-5目的基因，構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒pLXSN-Tum-5重組體，使用包裝細(xì)胞PA317將其包裝成假病毒顆粒感染NIH3T3細(xì)胞，獲得了pLXSN-Tum-5病毒顆粒[8]。前期實(shí)驗(yàn)[9]證實(shí)：Tum-5可明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖，通過(guò)下調(diào)Bcl-2、促進(jìn)Bax和Caspase-3表達(dá)誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生凋亡。在此基礎(chǔ)上，本課題以肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，體外檢測(cè)Tum-5對(duì)人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，體內(nèi)建立小鼠肝細(xì)胞癌移植瘤模型，檢測(cè)Tum-5對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的作用和對(duì)移植瘤內(nèi)新生血管的影響，以期為臨床腫瘤患者提供抗血管生成治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及主要試劑8～12周齡雌性昆明小鼠20只(體質(zhì)量15～20 g)，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2015-0005。人肝癌細(xì)胞株HepG-2和小鼠肝癌細(xì)胞株H22均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，MTT 試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗鼠CD31單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉試劑有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HepG-2和H22細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有 10%新生小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液(含 100 U·mL-1青霉素和 100 mg·L-1鏈霉素)中，在含有 5% CO2的 37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.3 體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，以8×103個(gè)/孔接種96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后分別加入不同感染復(fù)數(shù)(MOI)(0、1、5、10、25 和 50)的pLXSN和pLXSN-Tum-5病毒顆粒，置于37℃、含5% CO2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔加入MTT溶液20 μL(終濃度為0.5 g·L-1)，培養(yǎng)4 h后每孔加入DMSO 150 μL，充分溶解后酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A)值，檢測(cè)波長(zhǎng)590 nm，測(cè)定各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.4 小鼠肝細(xì)胞癌移植瘤模型的構(gòu)建剔去小鼠右側(cè)腋窩下及周圍毛發(fā)，碘伏皮膚常規(guī)消毒。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞配制成1×107mL-1的細(xì)胞懸液，以RPMI-1640培養(yǎng)基重懸。取0.1 mL分別注射到小鼠右側(cè)腋下已經(jīng)事先備皮的皮膚下，回抽無(wú)血，緩慢注入后迅速拔針，用酒精棉球稍按壓進(jìn)針處皮膚，即可完成接種，約1周左右成瘤，挑選移植瘤體積在30～70 mm3的小鼠分組實(shí)驗(yàn)，移植瘤模型成功建立。

1.5 體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)15只荷瘤小鼠隨機(jī)分成saline(生理鹽水)組、pLXSN組和pLXSN-Tum-5組，每組5只。在第 0、2、4、6和8天分別實(shí)施瘤內(nèi)注射saline和病毒顆粒(MOI=5)，共注射5次。治療效果和安全性分別通過(guò)測(cè)量腫瘤的體積、質(zhì)量和小鼠體質(zhì)量來(lái)評(píng)估。每2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，按公式V = ab2/2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤體積-時(shí)間生長(zhǎng)曲線。10 d后，采用頸椎離斷處死荷瘤鼠，完整剝離出瘤體，電子天平稱質(zhì)量，計(jì)算各組瘤體質(zhì)量的平均值。

1.6 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定小鼠肝癌移植瘤組織石蠟包埋后制備成5 μm切片，CD31單克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟參照免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，計(jì)算各組腫瘤微血管密度(MVD)。結(jié)果判定：高倍鏡(×200)視野下計(jì)數(shù)高密度區(qū)被抗CD31抗體染成棕色的血管數(shù)目，每個(gè)高密度區(qū)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的微血管計(jì)數(shù)，取其平均值為該標(biāo)本的MVD。

2 結(jié) 果

2.1 各組HepG-2細(xì)胞的增殖率采用不同MOI(0、1、5、10、25 和 50)的pLXSN-Tum-5和pLXSN病毒顆粒感染HepG-2細(xì)胞 72 h檢測(cè)細(xì)胞增殖率。pLXSN-Tum-5組隨著MOI的增高HepG-2細(xì)胞增殖率無(wú)明顯變化，與pLXSN組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組HepG-2細(xì)胞增殖率

Tab.1 Proliferation rates of HepG-2 cells in various groups

表1 各組HepG-2細(xì)胞增殖率

GroupProliferationrate(MOI)015102550pLXSN 10098．0±4．296．0±5．195．0±4．697．0±3．894．0±5．0pLXSN?Tum?5 10097．0±3．893．0±5．492．0±6．295．0±4．696．0±3．5

2.2 各組小鼠移植瘤體積各組荷瘤鼠在實(shí)驗(yàn)前6 d皮下移植瘤生長(zhǎng)速度未見(jiàn)明顯差異；第7天后瘤體生長(zhǎng)差異逐漸顯現(xiàn)，pLXSN-Tum-5組小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，滯后于pLXSN組和saline組。治療結(jié)束后，pLXSN-Tum-5組小鼠皮下移植瘤體積明顯低于saline組和pLXSN組(P< 0.05 或P< 0.01)；pLXSN組與saline組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)圖1。

*P<0.01 compared with saline group;△P< 0.05 compared with pLXSN group.

2.3 各組小鼠移植瘤質(zhì)量治療10 d后處死荷瘤鼠，切取腫瘤稱質(zhì)量并拍照，pLXSN-Tum-5組腫瘤大小與pLXSN組和saline組相比明顯縮小，見(jiàn)圖2(插頁(yè)三)。pLXSN-Tum-5組腫瘤質(zhì)量明顯低于saline組和pLXSN組(P< 0.05或P< 0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠移植瘤質(zhì)量

*P< 0.01 compared with saline group;△P< 0.05 compared with pLXSN group.

2.4 各組荷瘤鼠體質(zhì)量隔日測(cè)量各組荷瘤鼠體質(zhì)量，saline組、pLXSN組和pLXSN-Tum-5組荷瘤小鼠在治療過(guò)程中體質(zhì)量呈穩(wěn)步增加。治療10 d后3組小鼠的體質(zhì)量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)圖3。

2.5 各組移植瘤組織新生血管形態(tài)及MVD移植瘤組織內(nèi)可見(jiàn)形態(tài)不規(guī)則的新生血管,血管分布以腫瘤組織邊緣處多見(jiàn)。與saline組和pLXSN組比較，pLXSN-Tum-5組小鼠移植瘤組織中新生血管數(shù)目明顯減少，pLXSN-Tum-5組平均MVD值與saline組和pLXSN組比較明顯降低(P< 0.05)。見(jiàn)圖4(插頁(yè)三)和表3。

圖3 各組荷瘤鼠體質(zhì)量變化曲線

表3 各組小鼠移植瘤組織平均MVD值

*P< 0.05 compared with saline group;△P< 0.05 compared with pLXSN group.

3 討 論

研究[10-12]表明：Tum全長(zhǎng)基因具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。Tum-5作為Tum的抗血管生成活性片段，主要通過(guò)特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤活性，而不直接作用于腫瘤細(xì)胞[5,7,13]。有研究[14]表明：Tum-5體外可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。本研究為了驗(yàn)證Tum-5體外是否對(duì)肝癌細(xì)胞有直接的增殖抑制作用，選用HepG-2細(xì)胞株作為研究對(duì)象，選用不同濃度pLXSN-Tum-5和pLXSN病毒顆粒感染HepG-2細(xì)胞，檢測(cè)HepG-2細(xì)胞的增殖情況。本研究結(jié)果顯示：隨著pLXSN-Tum-5病毒顆粒濃度的增加，HepG-2細(xì)胞的增殖率并無(wú)明顯變化，與pLXSN對(duì)照組比較也無(wú)明顯變化，表明Tum-5體外對(duì)HepG-2細(xì)胞沒(méi)有直接的抗腫瘤活性?？紤]這種結(jié)果差異可以歸因于不同類型的腫瘤細(xì)胞。

腫瘤血管生成過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞活化、增殖、遷移和浸潤(rùn)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15-16]。 HCC血管豐富，通過(guò)特異性抗血管靶向干預(yù)抑制上述過(guò)程可成為HCC潛在的治療靶點(diǎn)。因此，本文作者采用小鼠皮下肝癌移植瘤模型，通過(guò)局部多點(diǎn)注射pLXSN和pLXSN-Tum-5病毒顆粒來(lái)檢測(cè)Tum-5的體內(nèi)抗腫瘤效果。治療5次后，pLXSN-Tum-5組小鼠腫瘤的體積和質(zhì)量明顯低于saline和pLXSN組，主要體現(xiàn)在小鼠皮下移植瘤體積的增大受到明顯抑制，并且最終腫瘤質(zhì)量的增加明顯減慢，說(shuō)明pLXSN-Tum-5組腫瘤細(xì)胞的成瘤活性和增殖能力均處于較低水平。此外，治療結(jié)束后3組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異，說(shuō)明pLXSN-Tum-5病毒顆粒在體內(nèi)起到抗腫瘤作用的同時(shí)未引起明顯的不良反應(yīng)。

MVD目前被認(rèn)為是評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)，以抗CD31抗體等標(biāo)記腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)單位面積中的微血管數(shù)目即為MVD[17-20]。為進(jìn)一步明確Tum-5對(duì)小鼠肝癌移植瘤內(nèi)血管生成的影響，對(duì)各治療組小鼠的瘤組織進(jìn)行CD31免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)MVD。本研究結(jié)果顯示：腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)形態(tài)不規(guī)則的新生血管，血管分布以腫瘤組織的邊緣處為多見(jiàn)。與saline和pLXSN組比較，pLXSN-Tum-5組小鼠腫瘤組織內(nèi)的平均MVD明顯降低，新生血管密度明顯減少，表明Tum-5體內(nèi)對(duì)肝癌組織有明顯的抗血管生成作用。

綜上所述，Tum-5對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖沒(méi)有直接的抑制作用，但可通過(guò)抑制肝癌組織內(nèi)新生血管的生成抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Tum-5基因片段可作為一種有效的血管生成抑制劑，為肝癌患者提供新的治療策略。

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