咖啡因聯(lián)合電離輻射對(duì)沉默Chk-1肝癌干細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用

于 雷，王志成，王鐵君

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

肝癌是全球5大常見(jiàn)腫瘤之一，放射治療已經(jīng)成為原發(fā)性肝癌的治療手段，并在我國(guó)的原發(fā)性肝癌診治指南得到推薦[1]。但是，由于腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)的存在，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而且是腫瘤放療抵抗的重要原因之一[2]，因此如何提高肝癌放療效果成為目前研究的熱點(diǎn)之一。腫瘤細(xì)胞受到輻射后，DNA的損傷如未修復(fù)則發(fā)生細(xì)胞凋亡[3]，檢查點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1，Chk-1)是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，具有重要的生理功能，當(dāng)Chk-1被抑制后，則調(diào)控周期阻滯的功能消失，使其成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。另外，咖啡因(caffeine)是一種茶葉、可可豆和咖啡果中的提取物，近期研究顯示其具有抗腫瘤作用，并且取得了較好的效果[4-6]。本研究探討咖啡因增強(qiáng)輻射對(duì)沉默了Chk-1的CD133+肝癌HepG2細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用，為改善肝癌細(xì)胞放療抵抗提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人肝癌HepG2細(xì)胞和人腎上皮293T細(xì)胞由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院王志成博士惠贈(zèng)。培養(yǎng)血清及高糖DMEM培養(yǎng)基(江蘇恩莫阿塞生物技術(shù)有限公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基、靶向沉默Chk-1的慢病毒載體pGIPZ-Chk-1 shRNA(第6外顯子)、非靶對(duì)照載體pGIPZ-control shRNA、質(zhì)粒pMD2G和pSPAX2由吉林大學(xué)衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和B27(美國(guó)Invitrogen公司)，puromycin、MTT試劑、咖啡因和碘化丙啶(PI)(美國(guó) Sigma公司)，重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和重組人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(美國(guó)Peprtech公司)，牛血清白蛋白(BSA)(美國(guó)Gbico公司)，AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)，CD133一抗(美國(guó)Abcam公司)，GAPDH、Chk-1兔多克隆抗體和ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(北京中山金橋公司)，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 沉默Chk-1的HepG2細(xì)胞模型的建立293T細(xì)胞接種6孔板，待80%～90%融合時(shí)，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將pGIPZ-Chk-1 shRNA、pMD2G和pSPAX2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48和72 h收取上清液并利用0.45 μm濾膜過(guò)濾后加到培養(yǎng)于6孔板80%～90%融合的HepG2細(xì)胞中，共感染2次。通過(guò)觀察綠色熒光的狀態(tài)判定感染的效率，并加入50 g·L-1的puromycin 10 μL進(jìn)行陽(yáng)性篩選，將獲得的細(xì)胞命名為HepG2-Chk-1，以pGIPZ-control作為非靶對(duì)照，命名為HepG2-control，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Western blotting法檢測(cè)Chk-1蛋白的表達(dá)收集HepG2、HepG2-Chk-1和HepG2-control組細(xì)胞，利用RIPA裂解細(xì)胞，總蛋白提取后進(jìn)行定量，按照25 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜后，利用TBST配置的5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃過(guò)夜GAPDH和Chk-1一抗孵育。含有0.05%Tween 20的TBST洗3次，每次5 min，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃下孵育1 h，TBST洗3次，利用化學(xué)發(fā)光試劑ECL進(jìn)行顯像，并進(jìn)行拍照分析。

1.4 沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞的獲得參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行肝癌干細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，DMEM/F12培養(yǎng)基中加入20 μg·L-1EGF、10 μg·L-1bFGF、2% B27、0.4% BSA、100 U· mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，約6 d可形成懸浮球，采用Western blotting法檢測(cè)CD133蛋白表達(dá)確定是否為肝癌干細(xì)胞，命名為S-HepG2-Chk-1細(xì)胞(沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞)和S-HepG2-control細(xì)胞(肝癌干細(xì)胞)。

1.5 細(xì)胞分組和照射S-HepG2-Chk-1和S-HepG2-control細(xì)胞分別分為對(duì)照組、咖啡因(0.2 mmol·L-1)組、4 Gy組和4 Gy+咖啡因組。 X射線(xiàn)照射采用X-RAD320生物輻照儀(美國(guó)PXI公司)，照射條件：電壓 180 kV，電流12.0 mA，靶皮距70 cm，劑量率 1.0 Gy·min-1，總劑量為4 Gy。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性收集各組肝癌干細(xì)胞懸浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照1× 104個(gè)/孔接種96孔板，參照1.4中的方法繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后加入終濃度為0.2 mmol·L-1的咖啡因，24 h后進(jìn)行X射線(xiàn)照射，計(jì)為0 h，分別于4、12、24和48 h加入MTT試劑，再培養(yǎng)4 h后吸去上清，加DMSO到孔底結(jié)晶處，于酶標(biāo)儀上490 nm處測(cè)定吸光度[A(490)]值，代表其增殖活性。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期收集肝癌干細(xì)胞懸浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照4 × 105個(gè)/孔接種24孔板，參照1.4中的方法繼續(xù)培養(yǎng)12 h后加入終濃度為0.2 mmol·L-1的咖啡因，24 h后進(jìn)行X射線(xiàn)照射，24 h后收集細(xì)胞，1 mol·L-1PBS洗2次，每個(gè)管中加入200 μL PI和100 μL RNaseA，輕微震蕩混勻，室溫條件避光20 min，上機(jī)收細(xì)胞，CellQuest軟件收集，ModFit軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以各期細(xì)胞百分率表示。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率收集各組肝癌干細(xì)胞懸浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照4 × 105個(gè)/孔接種24孔板，參照1.4中的方法繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后加入終濃度為0.2 mmol·L-1的咖啡因[9]，24 h后進(jìn)行X射線(xiàn)照射，24 h后收細(xì)胞，1 mol·L-1的PBS洗2次，每個(gè)管中加入5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC試劑，混勻后避光10 min，上機(jī)收細(xì)胞，CellQuest軟件收集數(shù)據(jù)，ModFit軟件分析，細(xì)胞凋亡率以百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1 沉默Chk-1的HepG2細(xì)胞模型的鑒定利用轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得的慢病毒感染HepG2細(xì)胞后獲得穩(wěn)定沉默Chk-1的細(xì)胞模型，通過(guò)Western blotting法檢測(cè)Chk-1蛋白的表達(dá)。HepG2和非靶對(duì)照shRNA的HepG2細(xì)胞中均可見(jiàn)Chk-1蛋白的表達(dá)，而靶向沉默Chk-1的HepG2細(xì)胞中Chk-1蛋白低表達(dá)，表明本研究獲得的沉默Chk-1的HepG2細(xì)胞模型成功。見(jiàn)圖1。

Lane 1：HepG2 cells；Lane 2：HepG2-control shRNA cells；Lane 3：HepG2-Chk-1 shRNA cells.

2.2 肝癌干洗胞懸浮球中CD133蛋白的表達(dá)根據(jù)Yoshikawa等[10]報(bào)道，肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志為CD133。在懸浮培養(yǎng)6 d后，收集細(xì)胞采用Western blotting法檢測(cè)，HepG2-control和HepG2-Chk-1細(xì)胞中可見(jiàn)CD133蛋白表達(dá)，而將2種細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后，CD133蛋白均高表達(dá)，提示細(xì)胞中高比例的CD133+細(xì)胞為肝癌干細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

Lane 1：HepG2-control cells；Lane 2：HepG2-Chk-1 cells；Lane 3：S-HepG2-control cells；Lane 4：S-HepG2-Chk-1 cells.

2.3 各組細(xì)胞增殖活性采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。在相同時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，同一種細(xì)胞的增殖活性均明顯降低(除了4 h時(shí)S-HepG2-control細(xì)胞)(P<0.05或P<0.01)，且以咖啡因 + 4 Gy組的細(xì)胞活性最低；與S-HepG2-control細(xì)胞比較，48 h時(shí)對(duì)照組，4、12、24和48 h時(shí)咖啡因組，12、24和48 h時(shí)4 Gy組，以及4、12、24和48 h時(shí)咖啡因 +4 Gy組 S-HepG2-Chk-1細(xì)胞活性均明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.4 各組細(xì)胞不同細(xì)胞周期百分率與對(duì)照組比較，咖啡因組S期和G2/M期細(xì)胞百分率明顯增加(P<0.05或P<0.01)，4 Gy組G0/G1期和G2/M期細(xì)胞百分率明顯增加(P<0.01)；咖啡因 + 4 Gy組S期細(xì)胞百分率明顯降低，而G2/M期細(xì)胞百分率明顯增加(P<0.05或P<0.01)。與S-HepG2-control 細(xì)胞比較，S-HepG2-Chk-1細(xì)胞G2/M期細(xì)胞百分率均明顯降低(P< 0.05或P< 0.01)。見(jiàn)表2。

表1 各組沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞的增殖活性

Tab.1 Proliferation activities of hepatocellular carcinoma stem cells silenced by Chk-1 in various groups

表1 各組沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞的增殖活性

GroupCellsA(490)value(t/h) 4122448ControlS?HepG2?control0．62±0．020．68±0．010．74±0．020．85±0．01S?HepG2?Chk?10．62±0．010．67±0．020．71±0．010．80±0．01△△CaffeineS?HepG2?control0．60±0．010．64±0．01?0．68±0．01?0．69±0．02??S?HepG2?Chk?10．56±0．02?△0．61±0．01?△0．63±0．02??△0．55±0．02??△△4GyS?HepG2?control0．54±0．02??0．58±0．01??0．63±0．01??0．70±0．01??S?HepG2?Chk?10．50±0．01??0．53±0．01??△0．57±0．01??△0．59±0．01??△△Caffeine+4GyS?HepG2?control0．41±0．02??0．42±0．01??0．54±0．01??0．56±0．01??S?HepG2?Chk?10．11±0．01??△△0．12±0．01??△△0．21±0．02??△△0．31±0．01??△△

*P< 0.05,**P< 0.01vscontrol group;△P< 0.05,△△P< 0.01vsS-HepG2-control cells.

表2 各組沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分率

Tab.2 Percentages of hepatocellular carcinoma stem cells silenced by Chk-1 at different phages in various groups

表2 各組沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞不同周期細(xì)胞百分率

GroupCellsPercentageofcellsG0/G1SG2/MControlS?HepG2?control47．07±0．9349．57±0．923．36±0．21S?HepG2?Chk?153．95±0．35△45．00±0．34△1．05±0．06？CaffeineS?HepG2?control32．80±1．49??60．43±1．62?6．77±0．31??S?HepG2?Chk?145．31±0．63??△49．24±0．71?△5．45±0．40?△4GyS?HepG2?control50．20±0．66?31．84±1．33??17．96±0．69??S?HepG2?Chk?157．03±0．28??△33．00±0．47??9．97±0．71??△△Caffeine+4GyS?HepG2?control34．67±0．92??39．03±0．55??26．30±1．11??S?HepG2?Chk?150．14±0．87?△△30．85±0．49??△△19．01±0．47??△

*P< 0.05,**P< 0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P< 0.01vsS-HepG2-control cells.

2.5 各組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，咖啡因組、4 Gy組和咖啡因 + 4 Gy組細(xì)胞凋亡率均明顯增加(P< 0.05或P< 0.01)，且咖啡因 + 4 Gy組增加最明顯；與S-HepG2-control細(xì)胞比較，各組S-HepG2-Chk-1細(xì)胞凋亡率均明顯增加(P< 0.05或P< 0.01)。見(jiàn)表3和圖3。

3 討 論

CSC為腫瘤組織中存在的非常小比例的細(xì)胞，具有無(wú)限自我更新和增殖能力，維持細(xì)胞群的生命力。CSC長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)，對(duì)腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有重要作用，同時(shí)也是腫瘤放療抵抗和化療多藥耐藥的影響因素之一，以CSC為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略越來(lái)越引起重視[11-12]。原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌，有學(xué)者認(rèn)為可能部分起源于肝癌干細(xì)胞。目前，識(shí)別CSC的表面標(biāo)志物被認(rèn)為是鑒定CSC的重要途徑。肝癌干細(xì)胞具有多個(gè)表面標(biāo)志物，如CD133、CD90、CD44、OV6和EpCAM等[13]。在本研究中懸浮培養(yǎng)6 d后，檢測(cè)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：與未懸浮的相同細(xì)胞比較，CD133蛋白呈高表達(dá)，提示有高比例的肝癌干細(xì)胞存在，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了保障。

表3 各組沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞的凋亡率

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsS-HepG2-control cells.

A-D:S-HepG2-control cells;E-H:S-HepG2-Chk-1 cells;A,E:Control group;B,F:Caffeine group;C,G:4 Gy group;D,H:Caffeine+4 Gy group.

腫瘤放療時(shí)損傷細(xì)胞的一個(gè)重要的機(jī)制就是誘導(dǎo)DNA損傷，繼而導(dǎo)致細(xì)胞最終走向死亡。DNA損傷時(shí)細(xì)胞周期Chk-1/2在限制細(xì)胞周期進(jìn)展的DNA損傷反應(yīng)通路中發(fā)揮重要作用[14]。腫瘤臨床放療時(shí)，往往因腫瘤細(xì)胞逃避了凋亡，使得以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為目的的治療方案效果降低，這與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的活化關(guān)系密切。當(dāng)細(xì)胞遭受DNA損傷劑作用時(shí)，Chk1被激活，致使細(xì)胞停留在S和G2/M期檢查點(diǎn)，保證DNA有充足的時(shí)間完成修復(fù)，從而維持基因組的穩(wěn)定性[15]。本研究中靶向Chk-1第6外顯子的靶向RNAi慢病毒pGIPZ-Chk-1感染肝癌細(xì)胞HepG2后，Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：Chk-1蛋白表達(dá)大大降低，具有較好的沉默效果，而對(duì)照序列的慢病毒則不影響Chk-1蛋白的表達(dá)。另外，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Chk-1被沉默的HepG2細(xì)胞和對(duì)照序列的HepG2細(xì)胞周期結(jié)果顯示：G2/M期細(xì)胞百分率明顯降低，表明經(jīng)過(guò)懸浮培養(yǎng)后沉默Chk-1的細(xì)胞更少的處于G2/M期。

2013年，美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)肝癌診治指南推薦：原發(fā)性肝癌患者無(wú)論腫瘤位于何處，都適合外照射放療。我國(guó)也在肝癌診治指南中推薦肝癌放療，而腫瘤放療與其他療法的聯(lián)合應(yīng)用則具有更高的治療效果。咖啡因廣泛存在于茶葉、咖啡和其他飲料中，有研究[16]表明：咖啡因能夠通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞凋亡和抑制增殖實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)。放療也可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此本研究將二者結(jié)合以增加彼此的誘導(dǎo)凋亡作用，并且以沉默了Chk-1的肝癌干細(xì)胞為靶細(xì)胞。沉默了Chk-1后G2/M期細(xì)胞比例減少，而該細(xì)胞周期是對(duì)X射線(xiàn)最敏感的期，這將對(duì)放射效果產(chǎn)生影響，但從本研究結(jié)果來(lái)看，二者協(xié)同作用于沉默Chk-1的肝癌干細(xì)胞能明顯提高其增殖抑制和凋亡促進(jìn)效果。另外，咖啡因?qū)τ诩?xì)胞周期的影響主要集中在S相延遲和G2/M期阻滯，而4 Gy照射則誘導(dǎo)G0/G1和G2/M期阻滯，對(duì)于逆轉(zhuǎn)因缺少Chk-1調(diào)控周期檢查點(diǎn)監(jiān)控失調(diào)具有一定的作用。

綜上所述，由沉默了Chk-1的HepG2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)獲得的肝癌干細(xì)胞G2/M期比例降低，本身不利于細(xì)胞維持正?；?，但對(duì)于腫瘤來(lái)說(shuō)，則有利于以此為突破口進(jìn)行靶向治療?？Х纫蚝碗婋x輻射均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)合應(yīng)用大大增強(qiáng)了單一治療的效果。本研究結(jié)果為肝癌的放射治療提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和思路。

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