Exendin-4對胰島素抵抗人肝癌HepG2細胞脂代謝相關因子基因表達的影響

蘇 寒，張美家，王懷杰，李 娜，霍連廣，李桂芝，戴 功，高志芹，楊曉云1,，曲梅花

(1.濰坊醫(yī)學院山東省高校應用藥理學重點實驗室，山東 濰坊 261053; 2. 濰坊醫(yī)學院藥學院藥理學教研室，山東 濰坊 261053；3. 濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院生物化學教研室，山東 濰坊 261053；4. 濰坊醫(yī)學院生物科學與技術學院細胞生物學教研室，山東 濰坊 261053)

Exendin-4(Ex-4)是從墨西哥巨型蜥蜴的唾液中分離得到的一種氨基酸多肽，可促進胰島素分泌[1]，改善胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。Ex-4具有穩(wěn)定性好、半衰期長的優(yōu)點，現(xiàn)已在臨床用于治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，其治療機制仍未完全闡明[2]。IR與多種疾病的發(fā)生有關，其中主要包括T2DM，如何改善IR是尋求治療T2DM及其他代謝疾病的一個重要途徑[3-4]。有研究[5]表明：IR在T2DM中更為普遍，導致了T2DM脂代謝的紊亂。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和載脂蛋白B100(apolipoprotein B100，apoB100)是維持肝臟脂代謝的關鍵環(huán)節(jié)[6]。本研究通過建立HepG2細胞IR模型，研究Ex-4處理對IR細胞葡萄糖消耗、細胞內(nèi)脂肪和甘油三酯(triglyceride,TG)的影響，以及對脂代謝相關因子ACC、FAS、SREBP-1c和 apoB100等表達的影響，闡明Ex-4對肝細胞脂代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑人肝癌HepG2細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)。DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清、胰酶、油紅O、蘇木素和牛胰島素(北京索萊寶科技有限公司)，Ex-4(美國MedChemExpress公司)，甘油三酯檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白定量試劑盒和Trizol(北京康為世紀生物科技有限公司)，SYBR Green PCR(日本TOYOBO公司)，PCR 引物(上海生工生物工程有限公司)，葡萄糖檢測試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)。

1.2 HepG2細胞IR模型建立HepG2細胞按1∶3比例傳代后，用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，待到細胞長滿80%左右，將細胞分為對照組和胰島素組。待細胞培養(yǎng)12 h 后，對照組加入不含胰島素的DMEM培養(yǎng)基，將李秀麗等[7]建立模型方法進行改進，胰島素組分別加入含1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol·L-1胰島素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、36和48 h。處理后分別取出細胞培養(yǎng)基上清液，應用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)檢測上清葡萄糖濃度，計算葡萄糖消耗量(mmol·L-1)。葡萄糖消耗量最低的一組即IR最佳模型組(葡萄糖消耗量=模型初始葡萄糖濃度-建模后葡萄糖濃度)。HepG2細胞建立IR模型(HepG2-IR細胞)后，然后將細胞分為對照組(不含胰島素誘導)、IR組(IR模型，即HepG2-IR細胞)和Ex-4組(HepG2-IR細胞中加入10 nmol·L-1Ex-4)。

1.3 油紅O染色在裝有載玻片的6孔板中建立HepG2細胞IR模型(HepG2-IR細胞)，IR模型建成后分組同上。吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，加入油紅O工作液孵育10 min；細胞爬片破膜10 min，PBS漂洗3次，每次5 min，入油紅O工作液37℃染色1～2 h。蘇木素復染1～2 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。在顯微鏡下觀察細胞中脂滴形成情況。用酶標儀測定各組細胞吸光度(A)值，計算細胞含脂率。細胞含脂率=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。

1.4 TG 水平檢測細胞分組同上。細胞長滿約1×106mL-1時，將細胞用胰酶消化，離心留沉淀，PBS洗3次后再次離心，留沉淀； 加入少許裂解液進行裂解，取部分上清液檢測TG水平。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測HepG2細胞中脂類代謝相關因子mRNA表達水平HepG2細胞建立IR模型后，分組同上。每個培養(yǎng)瓶中加入Trizol 1 mL，利用Trizol法提取細胞總RNA，RNA定量后進一步逆轉錄成cDNA。建立PCR反應體系，其中ACC、FAS、SREBP-1c和apoB100及GAPDH引物序列見表1，以GAPDH為內(nèi)參基因。反應條件：預變性95℃、10 min，變性95℃、10 s，退火60℃、30 s，共40個循環(huán)；熔解曲線為：從55℃到95℃，每隔10 s 增加0.5℃。使用LightCycler?480實時熒光定量PCR系統(tǒng)上機擴增，得出實驗數(shù)據(jù)，根據(jù)2-ΔΔCt計算各基因的相對表達水平。

表1 基因引物序列

2 結 果

2.1 IR模型建立在不同濃度胰島素作用下，HepG2細胞在24、36和48 h時葡萄糖消耗量見表2。與對照組比較，胰島素濃度為1×10-7mol·L-1作用36 h, HepG2葡萄糖消耗量最低，故本次實驗中應用的胰島素濃度為1×10-7mol·L-1、作用時間36 h為最佳造模條件。

2.2 各組細胞葡萄糖消耗量HepG2細胞誘導成IR形成后，采用GOD-POD法檢測各組細胞葡萄糖消耗量，IR組(36 h, 胰島素濃度為1×10-7mol·L-1)細胞葡萄糖消耗量[(1.656±0.133)mmol·L-1)]明顯低于對照組[(1.845±0.138)mmol·L-1)](P<0.01)，說明IR模型已建立。

與IR組比較，Ex-4組細胞的葡萄糖消耗量 [(2.190±0.080)mmol·L-1)] 明顯升高(P<0.05)。

2.3 各組細胞的形態(tài)表現(xiàn)及TG水平油紅O染色結果顯示：與對照組比較，IR組HepG2-IR細胞中紅色脂滴明顯增多；與IR組比較，Ex-4組細胞中紅色脂滴明顯減少(圖1，見插頁二)。與對照組(25%±6%)比較，IR組細胞含脂率(63%±12%)明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，Ex-4組細胞含脂率(34%±8%)明顯降低(P<0.05)。各組細胞中TG水平(mmol·g-1)檢測：與對照組(0.21±0.03)比較，IR組HepG2-IR細胞中TG水平(0.33±0.08)明顯升高(P<0.05)；Ex-4組HepG2-IR細胞中TG水平(0.24±0.04)明顯低于IR組(P<0.05)，接近對照組HepG2細胞中TG水平(P>0.05)，表明Ex-4通過調(diào)節(jié)TG的代謝影響細胞的脂質(zhì)代謝途徑，進而減少細胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚。

表2 不同濃度胰島素作用HepG2細胞24、36和48 h后葡萄糖消耗量

Tab.2 Glucose consumption of HepG2 cells treated with different concentrations of insulin for 24, 36 and 48 h

表2 不同濃度胰島素作用HepG2細胞24、36和48 h后葡萄糖消耗量

GroupGlucoseconsumption(t/h) 243648Control1．645±0．0981．845±0．1382．148±0．143Insulin(mol·L-1) 1×10-81．723±0．147?1．737±0．042?2．148±0．182 1×10-71．703±0．067?1．656±0．133?1．879±0．127 1×10-61．834±0．183?1．762±0．0532．012±0．129 1×10-52．034±0．108?1．937±0．0672．388±0．157

*P<0.05 compared with control group at same time.

2.4 各組細胞中脂類代謝相關因子mRNA 表達水平與對照組比較，IR組HepG2-IR細胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，apoB100 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)；與IR組比較，Ex-4細胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，apoB100 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組HepG2細胞中脂類代謝相關因子mRNA表達水平

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with IR group.

3 討 論

胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是腸道分泌的一種腸促胰島素[8]，能夠刺激胰島β細胞分化，改善細胞的胰島素敏感性，降低血糖，但其半衰期較短，作為臨床藥物常受到制約[9-11]。作為第一個臨床使用的GLP-1類似物藥物，Ex-4的特點是可模擬人體內(nèi)自然分泌的激素，調(diào)節(jié)血糖水平，且與GLP-1有相似的生物學作用，Ex-4具有半衰期長的優(yōu)點，在研究中更具有優(yōu)勢[12-13]。

IR與脂代謝異常有密切關聯(lián)，所以研究脂代謝的變化是尋找改善IR的一個重要途徑。本文作者主要是通過觀察Ex-4調(diào)節(jié)脂代謝的相關因子來探討Ex-4對IR的影響。脂代謝相關因子ACC和FAS是脂肪酸合成限速酶[14]，ACC、FAS等因子表達水平明顯增加，可引起肝臟內(nèi)脂肪酸合成增加、積累，導致肝細胞脂代謝異常，從而進一步加重IR；FAS還在結合與轉運脂質(zhì)和調(diào)節(jié)脂蛋白代謝等方面具有重要作用，其表達水平的升高能夠明顯增加TG在體內(nèi)的沉積從而使糖尿病的脂代謝紊亂[15-16]。本研究結果顯示： IR形成后，脂肪酸合成增加，脂類物質(zhì)聚集，ACC和FAS表達水平升高。

SREBP-1c是核轉錄因子，在脂肪酸的合成中發(fā)揮重要作用，SREBP-1c活性升高引起攝入游離脂肪酸增加[17]。本研究顯示：HepG2-IR細胞經(jīng)Ex-4處理后，SREBP-1c表達水平降低，提示Ex-4能夠減少游離脂肪酸的生成，改善脂肪酸合成異常的現(xiàn)象，使脂肪酸合成減少。apoB100在肝臟中合成，是低密度脂蛋白的載脂蛋白，參與低密度脂蛋白的轉運[18-19]。本研究結果顯示：Ex-4處理HepG2-IR細胞后，apoB100 mRNA表達水平升高，說明Ex-4通過影響apoB100表達使其能夠加劇游離脂肪酸的轉運。

研究[20]表明：Ex-4可提高誘導的3T3-L1脂肪細胞IR模型的葡萄糖攝取量，從而改善脂肪細胞的IR。Ex-4在抑制人或動物體質(zhì)量增長、促進膽固醇代謝和改善胰島素敏感性方面具有重要作用，可防止高脂誘導的IR[21-22]。本研究結果顯示：Ex-4能夠增加 HepG2-IR細胞的葡萄糖消耗量，降低TG的水平，與上述文獻報道一致。

綜上所述，Ex-4可調(diào)節(jié)脂代謝的過程，改善脂肪酸合成異常，進而改善IR。本研究結果為Ex-4成為臨床一線抗糖尿病藥物提供了理論依據(jù)。

[1] 鄭云程. GLP-1受體長效激動劑GLP-1-exendin-4/IgG4(Fc)融合蛋白的制備與生物效應 [J]. 藥學學報, 2015,50(12):1668-1672.

[2] 畢 華，劉 蘭，韓春梅，等. Exendin-4的研究進展 [J]. 藥物分析雜志, 2010,30(12):2441-2445.

[3] Kharroubi AT, Darwish HM. Diabetes mellitus: The epidemic of the century [J]. World J Diabetes, 2015, 6(6):850-867.

[4] Mao GH, Lu P, Wang YN, et al. Role of PI3K p110β in the differentiation of human embryonic stem cells into islet-like cells [J]. Biochem Biophys Res Commun,2017, 488(1): 109-115.

[5] 鄭春喜，田潤華，申黎艷. L-阿拉伯糖防治胰島素抵抗相關疾病的研究進展 [J]. 青島大學醫(yī)學院學報, 2016, 52(2): 251-252.

[6] 周 楠，蔣維維，劉 娟, 等. HepG2細胞胰島素抵抗模型中脂代謝的改變 [J]. 南京醫(yī)科大學學報:自然科學版, 2016, 36(6): 705-709.

[7] 李秀麗，賀嵩敏，朱 瑩，等. HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立與鑒定 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(5): 203-207.

[8] Song G, Yang D, Wang Y, et al. Human GLP-1 receptor transmembrane domain structure in complex with allosteric modulators [J]. Nature, 2017, 546(7657):312-315.

[9] Lee SJ, Diener K, Kaufman S, et al. Limiting glucocorticoid secretion increases the anorexigenic property of Exendin-4 [J]. Mol Metab, 2016, 5(7):552-565.

[10]韓江莉. 胰高血糖素樣肽-1受體激動劑的心血管作用[J]. 心血管病學進展, 2013, 34(1):56-59.

[11]中華醫(yī)學會糖尿病學分會. 基于胰高血糖素樣肽1降糖藥物的臨床應用共識 [J]. 中華糖尿病雜志, 2014, 6(1):14-20.

[12]Lee J, Hong SW, Park SE, et al. Exendin-4 inhibits the expression of SEPP1 and fetuin-A via improvement of palmitic acid-Induced endoplasmic reticulum stress by AMPK[J]. Endocrinol Metabolism, 2015, 30(2):177-184.

[13]楊文英. 人GLP-1類似物利拉魯肽的最新研究進展 [J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2010, 26(9): 841-844.

[14]丁 婧，王 輝，余詩灝，等. 肥胖大鼠模型的建立及其脂代謝相關分子機制研究 [J]. 中國實驗動物學報, 2012, 20(5):20-24.

[15]程莉娟，成細華，喻 嶸，等. 左歸降糖清肝方對小鼠糖尿病合并脂肪肝脂代謝相關基因mRNA表達的影響 [J]. 中國老年學雜志,2013,33(17):4182-4184.

[16]Hofbauer HF, Schopf FH, Schleifer H, et al．Regulation of gene expression through a transcriptional repressor that senses acyl-chain length in membrane phospholipids [J]. Dev Cell, 2014, 29(6): 729-739.

[17]Musso G, Gambino R, Cassader M. Recent insights into hepatic lipid metabolism in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) [J]. Prog Lipid Res, 2009, 48(1): 1-26.

[18]袁美玲，倪紅兵. 2型糖尿病載脂蛋白ApoAl、ApoBl00檢測的臨床研究 [J]. 南通醫(yī)學院學報,2009, 29(6): 432-433.

[19]Camporez JP, Kanda S, Petersen MC, et al. ApoA5 knockdown improves whole-body insulin sensitivity in high-fat fed mice by reducing ectopic lipid content [J]. J Lipid Res, 2015, 56(3): 526-536.

[20]馬 麗，官濱斌，王林曦，等. Exendin-4可通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號標志蛋白表達改善3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗 [J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(7):1258-1263.

[21]李清明，楊剛毅，李 伶，等. Exendin-4改善胰島素抵抗的作用機制研究 [J]. 中國糖尿病雜志, 2008, 16(7):405-408.

[22]Cd G, Donnelly D, Wootten D, et al. Glucagon-like peptide-1 and its class b g protein-coupled receptors: A long march to therapeutic successes [J]. Pharmacol Rev, 2016, 68(4):954.