粗毛纖孔菌對(duì)寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)的影響及譜效關(guān)系分析

李慶杰，包海鷹,2，圖力古爾，李 玉

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長(zhǎng)春 130118; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

粗毛纖孔菌[(Inonotushispidus(Bull.:Fr.)P.Karst]為擔(dān)子菌亞門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、繡革孔菌科(Hymenochaetaceae)、纖孔菌屬(Ionnouts)藥用真菌，目前發(fā)現(xiàn)其主要寄生于桑樹、楊樹、榆樹、水曲柳、槭樹和胡桃楸等樹種上[1-2]。在我國(guó)新疆、吉林、黑龍江、遼寧和內(nèi)蒙古等地均有分布[3]。粗毛纖孔菌被國(guó)內(nèi)學(xué)者考證為桑黃[4-5]。研究[6-8]表明：粗毛纖孔菌富含多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化和抑菌等功效。

在新疆維吾爾自治區(qū)將生長(zhǎng)在桑樹上的粗毛纖孔菌稱為桑黃。古代本草記載桑黃具有活血止痛、清熱解毒的功效[3]?！端幮哉摗分杏涊d“桑黃，性甘辛，無毒。治女子崩中帶下，月閉血凝，產(chǎn)后血凝”，是治療月經(jīng)病的傳統(tǒng)藥材[9]，但目前，尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道粗毛纖孔菌具有治“女子崩中帶下，月閉血凝，產(chǎn)后血凝”的藥理作用。本文作者通過分時(shí)間段采集，得到了寄生于不同樹種上的粗毛纖孔菌子實(shí)體，擬探討生長(zhǎng)在不同樹種上的粗毛纖孔菌是否對(duì)寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)產(chǎn)生影響，為粗毛纖孔菌是否為古代本草記載的“桑黃”提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

SPF級(jí)Wistar大鼠180只，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK-(遼)2015-0001，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。6種粗毛纖孔菌子實(shí)體分別采自吉林省和新疆維吾爾自治區(qū)，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)圖力古爾教授鑒定，具體信息見表1。本文作者將6個(gè)樣品命名為S1～S6：S1(黑色，寄生于水曲柳)，S2(黑色，寄生于蒙古黃榆)，S3(黃色，寄生于水曲柳)，S4(黃色，寄生于桑樹)，S5(黃色，寄生于楊樹)，S6(黃色，寄生于蒙古黃榆)。6份粗毛纖孔菌子實(shí)體分別用10倍量水煎煮2次，每次2 h，煎煮液濃縮，凍干，粉碎，得到提取干膏粉，作為實(shí)驗(yàn)用樣品。陽(yáng)性對(duì)照藥品為復(fù)方丹參片(廣東白云山和記黃埔中藥有限公司，批號(hào)：20160903)。鹽酸腎上腺素注射液[遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國(guó))有限公司，批號(hào)：111102)]。

表1 粗毛纖孔菌子實(shí)體來源信息

1.2 主要儀器

血液流變測(cè)試儀(BT-300)購(gòu)自北京博萊特醫(yī)藥技術(shù)有限公司，高效液相色譜儀(島津 LC-20A)購(gòu)自日本島津公司。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、血瘀模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和低、高劑量粗毛纖孔菌子實(shí)體(S1～S6)組，共15組，每組12只大鼠。正常對(duì)照組和模型組大鼠給予等體積的蒸餾水。低劑量粗毛纖孔菌子實(shí)體組大鼠每日給藥量相當(dāng)于生藥5.2 g·kg-1，高劑量粗毛纖孔菌子實(shí)體組大鼠每日給藥量相當(dāng)于生藥7.8 g·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠按服用說明計(jì)算給予相應(yīng)劑量復(fù)方丹參片。每天給藥1次，連續(xù)灌胃給藥7 d。

1.4 大鼠血瘀證模型制備[10-11]

于末次給藥后30 min，除正常對(duì)照組外，其他各組大鼠均經(jīng)皮下注射鹽酸腎上腺素注射液(1 mg·kg-1)。2 h后，將動(dòng)物放入4℃冰水中浸泡5 min取出。2 h后，再次皮下注射相同劑量鹽酸腎上腺素。禁食20 h后，腹腔注射20%烏來糖(5 mL·kg-1)麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺取血3 mL，以0.1%肝素抗凝。取其中1 mL全血用血液流變儀檢測(cè)全血黏度(mPa.s)；其余抗凝血液以3 000 r·min-1離心15 min，取血漿1 mL用血液流變儀檢測(cè)血漿黏度(mPa.s)。

1.5 譜效關(guān)系分析實(shí)驗(yàn)

1.5.1 溶液配制 供試品溶液：稱取粉碎過40目篩的粗毛纖孔菌子實(shí)體10 g，加甲醇超聲處理4次，每次30 min，每次加甲醇10倍量，濾過，濾液合并，蒸干，再加30 mL蒸餾水溶解，用石油醚(60℃～90℃)萃取3次，每次30 mL，棄去石油醚層，水層用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯層，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ苤? mL容量瓶中，濾過即得。對(duì)照品溶液：稱取phellibaumin A、phelligridin C(反式)、phelligridin D和3′4′-dihydroxy-5-[(11-hydroxyphenyl)-6,7-vinyl]-3,5-dioxa-fluoren-5-one自制對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇，配成0.2 g·L-1的對(duì)照品溶液。

1.5.2 色譜條件[12-13]流動(dòng)相A(0.1%甲酸溶液)，流動(dòng)相B(甲醇)，采用梯度洗脫，具體梯度洗脫程序見表2。菲羅門色譜柱(Kinetex 2.6u XB-C18 100A，美國(guó)菲羅門公司),柱溫30℃,流速1.0 mL·min-1,二極管陣列檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)400 nm,進(jìn)樣量10 μL。

1.5.3 譜效關(guān)系分析 對(duì)6個(gè)不同來源樣品成分進(jìn)行色譜分析，對(duì)每個(gè)樣品中特征峰的量化峰面積和對(duì)寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)的影響應(yīng)用灰色系統(tǒng)理論建模軟件(GSTAV 7.0)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，相關(guān)系數(shù)>0.8表明具有相關(guān)性[14-15]

表2 梯度洗脫序列時(shí)間表

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 粗毛纖孔菌子實(shí)體煎煮后出膏率

因生長(zhǎng)環(huán)境不同，不同樹種上生長(zhǎng)的粗毛纖孔菌水提取出膏率有明顯差異，其中以蒙古黃榆樹為最高，楊樹最低。不同采集時(shí)間樣品比較，自然脫落、黑色的粗毛纖孔菌子實(shí)體出膏率均明顯低于黃色子實(shí)體，表明粗毛纖孔菌的采收時(shí)間或生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)粗毛纖孔菌品質(zhì)有較大影響。見表3。

表3 粗毛纖孔菌煎煮出膏率

2.2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿黏度和全血黏度均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，寄生于桑樹、楊樹、水曲柳和蒙古黃榆樹的高劑量粗毛纖孔菌黃色子實(shí)體(S3～S6)組大鼠血漿黏度和全血黏度均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，寄生于同一樹種的粗毛纖孔菌黑色子實(shí)體(S1和S2)組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

Tab.4 Hemorheological indexes of rats in various groups

表4 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

GroupBloodviscosity180s-1100s-130s-13s-1Plasmaviscosity(180s-1)Normalcontrol8．32±1．279．80±1．0215．37±2．1862．90±8．90458．58±91．87Model8．63±1．61?10．76±1．17?17．43±2．40?75．17±8．84?504．10±85．06?Positivedrug8．43±0．70△10．18±0．98△15．94±3．04△67．20±9．79△476．64±93．02△S1 Highdose8．67±0．7210．41±1．4717．87±2．4174．49±8．57497．68±85．31 Lowdose8．79±2．6410．21±3．6317．88±7．4574．45±8．53500．82±85．94S2 Highdose8．78±1．7410．52±2．2417．7±3．5574．12±9．83499．49±76．72 Lowdose8．74±1．1310．72±1．7617．93±4．0674．15±7．62496．32±68．78S3 Highdose8．51±2．42△10．33±0．50△16．54±6．66△70．40±9．89△479．44±130．24△ Lowdose8．69±1．7910．73±1．1217．22±5．3375．31±7．50491．41±91．58S4 Highdose8．49±2．58△10．47±0．46△16．87±4．59△72．43±7．72△488．46±65．91△ Lowdose8．65±2．5110．96±1．6117．15±5．3574．14±7．86500．93±85．31S5 Highdose8．46±0．68△10．31±0．78△16．69±2．07△69．21±8．51△484．09±65．03△ Lowdose8．59±0．8710．61±1．3017．46±2．7274．43±8．41502．45±72．93S6 Highdose8．50±1．91△10．39±1．14△17．09±6．14△72．78±9．61△480．26±54．90△ Lowdose8．66±1．7310．69±2．2217．85±4．6875．58±9．19503．96±61．76

*P<0. 05 compared with normal control group;△P<0. 05 compared with model group.

2.3 粗毛纖孔菌成分對(duì)寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)影響的譜效關(guān)系分析

利用1.5.2中的色譜條件對(duì)6個(gè)不同來源樣品(S1～S6)的成分進(jìn)行色譜分析，應(yīng)用灰色系統(tǒng)理論建模軟件(GSTAV 7.0) 對(duì)其中32個(gè)特征峰的量化峰面積和對(duì)寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)影響進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果見表5。不同來源粗毛纖孔菌色譜峰差異情況見圖1。在本研究的色譜條件下，32個(gè)特征峰為S1、S2、S3、S4、S5、S6樣品共有峰，通過觀察發(fā)現(xiàn)S1樣品中的主要色譜峰集中在100～133 min，S2樣品中的主要色譜峰集中在100～120 min，S3、S4、S5、S6樣品中的主要色譜峰分布較分散，通過對(duì)特征峰的量化峰面積和對(duì)寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)影響進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析得出，保留時(shí)間為73、75、79、81、90、94、98、100、146、161和167 min的各峰與血漿黏度變化有明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均>0.8，樣品S1和S2的主要色譜峰保留時(shí)間為101、105、109、115、118、125和129 min，相關(guān)系數(shù)均<0.5，灰色系統(tǒng)理論建模軟件中規(guī)定相關(guān)系數(shù)小于0.8被定義為不具有相關(guān)性，因此樣品S1和S2中保留時(shí)間在100～120 min的主要色譜峰對(duì)活血化瘀作用所起的作用不大，而起活血化瘀作用的色譜峰分布在53～100 min和140～160 min，樣品S3、S4、S5、S6中主要色譜峰均分布在這2個(gè)時(shí)間區(qū)間，經(jīng)過保留時(shí)間對(duì)比，確定保留時(shí)間為73、75、79和81 min的色譜峰分別為phellibauminA、phelligridinD、phelligridinC(反式)和3′4′-dihydroxy-5-[(11-hydroxyphenyl)-6,7-vinyl]-3,5-dioxa-fluoren-5-one。

表5 各特征峰與藥效的相關(guān)性

S1：Black (Parasitize in Fraxinus mandschurica Rupr);S2： Black (Parasitize in Ulmus macrocarpa var. mongolica);S3： Yellow(Parasitize in Fraxinus mandschurica Rupr);S4： Yellow(Parasitize in Morus alba L.)；S5：Yellow (Parasitize in Populus L)；S6：Yellow (Parasitize in Ulmus macrocarpa var. mongolica).

3 討 論

“桑黃”是目前國(guó)際公認(rèn)的具有良好的抗癌及提高人體免疫力活性的藥用真菌，但是不同的國(guó)家、不同的地區(qū)對(duì)“桑黃”的認(rèn)識(shí)有差異[16]。目前盡管有許多學(xué)者致力于“桑黃”的正本清源，但是藥材品種上仍然存在混亂現(xiàn)象，同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，與古代文獻(xiàn)的記載不符。古代文獻(xiàn)對(duì)“桑黃”的藥效記載：“黑者，主女子漏下赤白汁，血病，癥瘕積聚，腹痛，陰陽(yáng)寒熱無子。療止久泄，益氣不饑。其金色者，療痹飲，積聚，腹病，金瘡”。而這些疾病與現(xiàn)代的很多體內(nèi)腫瘤或癌性胸腹水、免疫功能低下等癥相當(dāng)?，F(xiàn)代研究[17-22]表明：粗毛纖孔菌有很好的抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降血糖、抑菌和增強(qiáng)免疫作用。由此看來，“桑黃”在古書中記載功效與粗毛纖孔菌的藥理作用有相同之處。為進(jìn)一步證明粗毛纖孔菌即為“桑黃”，針對(duì)《藥性論》中“桑黃，性甘辛，無毒，治女子崩中帶下，月閉血凝，產(chǎn)后血凝”這一記載，本研究選擇寒凝血瘀模型大鼠對(duì)粗毛纖孔菌的活血化瘀作用進(jìn)行考察，結(jié)果表明：寄生于不同樹種的粗毛纖孔菌黃褐色子實(shí)體具有活血化瘀的功效，與《藥性論》《大觀本草》中“桑黃”的功效記載相符；寄生于不同樹種的散落于地面的粗毛纖孔菌黑色子實(shí)體雖然也具有一定活血化瘀功效，但未能改變寒凝血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)。譜效關(guān)系研究表明:S1和S2樣品的主要色譜峰保留時(shí)間為100～130 min，該區(qū)間的色譜峰所代表化學(xué)成分與粗毛纖孔菌活血化瘀活性不具有相關(guān)性；S3、S4、S5和S6主要色譜峰保留時(shí)間在53～100 min和140～160 min，該區(qū)域間的色譜峰所代表化學(xué)成分與粗毛纖孔菌活血化瘀活性密切相關(guān)。分析表明該區(qū)域色譜峰主要為酚酸類化合物，初步證明粗毛纖孔菌中具有活血化瘀作用的成分為酚酸類物質(zhì)，不同樹種間粗毛纖孔菌活性比較無明顯差異，同一樹種自然成熟仍長(zhǎng)在樹干的子實(shí)體與脫落至地面變黑的子實(shí)體間活性有明顯差異，脫落至地面的子實(shí)體可能為非正常成熟脫落地面至黑或隨正常成熟但脫落地面后經(jīng)雨淋等因素引起其中成分變化，導(dǎo)致活血化瘀作用減弱。

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