異氟醚對缺鋅APP/PS1轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

馮安琪,劉 楠,樸美花,苑 野,裴愛月,劉 婭,馮春生

(1.吉林大學第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春130021;2. 吉林大學第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心，吉林 長春 130021; 3. 吉林大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，吉林 長春130021)

每年全球近千萬阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者接受全身麻醉。研究[1-3]顯示：常用吸入麻醉藥異氟醚能夠增加海馬β淀粉樣蛋白(amyloid β-peptide，Aβ)聚集和Tau蛋白過度磷酸化，加重神經(jīng)元凋亡等AD神經(jīng)病理進程，但其相關機制及影響因素尚不清楚。鋅是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要微量金屬元素之一，在參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成和維持神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)及生理功能等方面發(fā)揮重要作用[4-7]。研究[8-15]顯示：缺鋅能夠引起細胞凋亡，導致包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的發(fā)生。流行病學調(diào)查[8,15]顯示：AD患者缺鋅發(fā)生率高，約25% AD人群存在血鋅水平降低。然而，缺鋅是否為異氟醚促進AD進展的風險因素，臨床相關異氟醚麻醉對缺鋅AD患者的神經(jīng)病理影響尚不完全清楚。為此，本研究擬采用缺鋅APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，探討異氟醚麻醉對缺鋅AD小鼠海馬神經(jīng)元凋亡和Aβ表達的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和抗體APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心(動物合格證號：11400700087484)，在標準實驗室條件下(白天/黑夜 12 h∶12 h，溫度22℃,濕度60%，4～5只/籠)飼養(yǎng)，出生2周后行基因型檢測。飼料是以AIN 93標準飼料為基礎的半純化飼料，購自天津軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所。應用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測飼料鋅含量。

鼠單克隆抗Aβ抗體、鼠單克隆抗Aβ40抗體和兔單克隆抗Bax抗體(Abcam公司,美國)，鼠單克隆抗β肌動蛋白抗體、鼠單克隆抗GAPDH抗體和DAPI(Sigma公司,美國)，鼠單克隆抗Aβ42抗體(COVANCE公司,美國)，Caspase-3抗體(Cell Signaling Technology公司,美國)，鼠抗NeuN單克隆抗體(Millipore公司,美國)，異氟醚(Abbott公司，美國)，蛋白酶抑制劑(Roche公司，瑞士)。

1.2 實驗動物分組8和9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為4組，每組24只。① 常鋅組(ZA組)：8月齡小鼠給予常鋅飼料(鋅含量 30 mg·kg-1)2個月；② 常鋅+異氟醚組(ZA+Iso組)：8月齡小鼠給予常鋅飼料2個月后接受1.4%異氟醚麻醉2 h；③ 缺鋅組(ZD組)：9月齡小鼠給予低鋅飼料(鋅含量1 mg·kg-1)1個月；④ 缺鋅+異氟醚組(ZD+Iso組)：9月齡小鼠給予低鋅飼料1個月后接受1.4%異氟醚麻醉2 h。

1.3 小鼠血清鋅和腦鋅水平測定應用ICP-MS分別檢測8月齡(建模前)和10月齡(建模后)小鼠血清鋅水平，成功建立缺鋅AD模型后檢測各組10月齡小鼠腦鋅水平。

1.4 異氟醚麻醉常鋅+異氟醚組和缺鋅+異氟醚組小鼠在特制麻醉箱中接受全麻，吸入3%異氟醚和3 L·min-1氧氣的混合氣體，當小鼠翻正反射消失后持續(xù)吸入1.4%異氟醚和1 L·min-1氧氣麻醉2 h。麻醉箱中放置體積分數(shù)為0.03%的CO2、加溫毯和紅外線燈。麻醉過程中小鼠保持自主呼吸，監(jiān)測血壓、心率、血氧飽和度和肛溫。應用紅外線吸收裝置持續(xù)監(jiān)測麻醉箱流出氣體中異氟醚、氧氣和CO2的濃度。常鋅組和缺鋅組小鼠在相同麻醉箱中持續(xù)吸入相同濃度和流量的氧氣2 h。麻醉結(jié)束后吸入3 L·min-1純氧，小鼠翻正反射恢復20 min后將所有小鼠放回其各自籠中。

1.5 免疫熒光雙染色檢測小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率每組隨機選取6只小鼠，分別于麻醉后6和24 h腹腔注射氯胺酮(10 g·L-1)和甲苯噻嗪(1 g·L-1)混合液(0.01 mL·g-1體質(zhì)量)，麻醉后暴露心臟，用冰冷的磷酸鹽緩沖液行穿心灌注，直至肝臟顏色變白后迅速取出鼠腦，沿中線將其分為左、右兩部分。左半腦組織先于干冰中冷凍5 min，于-80℃儲存。右半腦組織用4%多聚甲醛固定過夜，行石蠟包埋和切片(4 μm)。切片經(jīng)抗NeuN抗體染色后，根據(jù)試劑盒說明書行TUNEL染色，DAPI覆蓋切片，應用光學顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元凋亡情況。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/(凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù))×100%。

1.6 Western blotting法檢測小鼠腦組織中Aβ、Aβ40、Aβ42、Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平將小鼠左半腦海馬組織從-80℃冰箱中取出，取0.2 g置入EP管中，加入冰冷的RIPA裂解液，4℃、8 000 g離心5 min，取其上清。蛋白質(zhì)樣本依據(jù)待測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，由12%SDS-PAGE分離并應用半干式電轉(zhuǎn)移器(45 V,4℃ 過夜,Amersham TE 70)將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加封閉液后在搖床上室溫振蕩1 h，再加入特異性一抗，4℃冰箱過夜，而后進行洗膜和二抗孵育。采用凝膠成像和免疫印跡檢測系統(tǒng) (WEALTEC公司,美國)測量條帶吸光度(A)值，以目的蛋白條帶A值與β-actin條帶A值的比值表示目的蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠血清鋅和腦鋅檢測結(jié)果造模前各組小鼠血清鋅水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與常鋅組比較，10月齡缺鋅組和缺鋅+異氟醚組小鼠血清鋅和腦組織中鋅水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，表明成功建立缺鋅APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型。見表1和2。

表1 各組小鼠模型建立前后血清鋅水平

*P<0.01 compared with ZA group.

表2 各組小鼠模型建立后皮層和海馬組織中鋅水平

*P<0.05,**P<0.01 compared with ZA group.

2.2 各組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率TUNEL染色陽性代表各種神經(jīng)細胞的凋亡(包括神經(jīng)元細胞)；NeuN染色陽性代表神經(jīng)元細胞的凋亡，當NeuN染色陽性細胞增多，則表示凋亡的神經(jīng)元細胞數(shù)量的增加。與常鋅組比較，常鋅+異氟醚組小鼠接受異氟醚麻醉后6 h海馬神經(jīng)元凋亡率增高 (P<0.05)，麻醉后24 h海馬神經(jīng)元凋亡率無明顯變化 (P>0.05)。與常鋅組比較，缺鋅組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率增高(P<0.01)，缺鋅+異氟醚組小鼠接受異氟醚麻醉后6 和24 h海馬神經(jīng)元凋亡率進一步增高(P<0.01)。與缺鋅組比較，缺鋅+異氟醚組小鼠接受異氟醚麻醉后6 和24 h海馬神經(jīng)元凋亡率增高(P<0.05)。見圖1(插頁一)和表3。

表3 異氟醚麻醉后各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率

*P<0.05，**P<0.01 compared with ZA group；△P<0.05 compared with ZD group.

2.3 各組小鼠海馬組織中Aβ蛋白表達水平與常鋅組比較，常鋅+異氟醚組小鼠海馬組織中總Aβ、Aβ40和Aβ42蛋白表達水平均無明顯變化(P>0.05)，缺鋅組小鼠海馬組織中總Aβ和Aβ40蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，而Aβ42蛋白表達水平升高(P<0.05)；缺鋅+異氟醚組小鼠海馬組織中Aβ和Aβ40蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，Aβ42蛋白表達水平進一步升高(P<0.01)。與缺鋅組比較，缺鋅+異氟醚組小鼠海馬組織中Aβ42蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖2和表4。

Lane 1:ZA group; Lane 2:ZA+Iso group; Lane 3:ZD group; Lane 4:ZD+Iso group.

表4 各組小鼠海馬組織中總Aβ、Aβ40和Aβ42蛋白表達水平

*P<0.05,**P<0.01 compared with ZA group；△P<0.05 compared with ZD group.

2.4 各組小鼠海馬組織中Cleaved caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值與常鋅組比較，常鋅+異氟醚組、缺鋅組和缺鋅+異氟醚組小鼠海馬組織中Cleaved caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值均增加(P<0.05或P<0.01)。與缺鋅組比較，缺鋅+異氟醚組小鼠海馬Cleaved caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值明顯增加(P<0.05或P<0.01)。見圖3、4和表5。

Lane 1:ZA group; Lane 2:ZA+Iso group; Lane 3:ZD group; Lane 4:ZD+Iso group.

Lane 1:ZA group; Lane 2:ZA+Iso group; Lane 3:ZD group; Lane 4:ZD+Iso group.

表5 各組小鼠海馬CA1區(qū)Cleaved caspase-3蛋白表達水平和Bax/Bcl-2比值

*P<0.05,**P<0.01 compared with ZA group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with ZD group.

3 討 論

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是目前應用最廣泛的AD小鼠模型之一，6月齡開始出現(xiàn)海馬區(qū)Aβ大量沉積，10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠處于AD臨床前期。吸入麻醉藥異氟醚是目前臨床最常用全身麻醉藥之一，常用濃度為1.0%～2.0%。因此，本研究選擇10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于1.4%異氟醚2 h，觀察異氟醚麻醉對臨床前期AD海馬神經(jīng)元凋亡的影響。

AD發(fā)病機制復雜，病因尚不十分清楚，其主要神經(jīng)病理表現(xiàn)為Aβ聚集、Tau蛋白過度磷酸化和神經(jīng)元凋亡等。研究[1,16-17]表明：全射麻醉能夠加重AD的神經(jīng)病理改變。研究[1-3,16]顯示：常用吸入麻醉藥異氟醚具有與AD密切相關的神經(jīng)毒性，能夠促進Aβ沉積和Tau蛋白過度磷酸化，加劇AD神經(jīng)元凋亡等神經(jīng)病理進程。然而，臨床常用濃度異氟醚麻醉是否加重臨床前期AD患者神經(jīng)病理進程及其相關影響因素，尚需進一步研究。

金屬元素鋅是機體重要的必需微量元素之一，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與多種蛋白的合成和信號通路的轉(zhuǎn)導，發(fā)揮重要生物學效應。研究[17-18]顯示：缺鋅加劇AD動物以及AD患者的Aβ沉積和細胞凋亡等神經(jīng)病理進程。調(diào)查[15,19]顯示：AD患者發(fā)生缺鋅風險高，全球近25%AD患者伴有不同程度的鋅缺乏。研究[20]顯示：鋅缺乏能夠促進海馬神經(jīng)元凋亡，影響AD神經(jīng)病理進程。本研究結(jié)果顯示：與常鋅組比較，缺鋅組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率增加，缺鋅+異氟醚組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率進一步增加，表明缺鋅不僅能夠誘導海馬神經(jīng)元凋亡，還能夠加劇異氟醚麻醉AD小鼠的神經(jīng)病理進程，進一步加重海馬神經(jīng)元凋亡。

AD等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中神經(jīng)細胞的最終結(jié)局為細胞凋亡。AD時腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生和清除機制失平衡，Aβ大量沉積，通過細胞凋亡等途徑導致神經(jīng)元死亡，引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性變[2,21]。研究[3,22-26]顯示：暴露異氟醚能夠增加細胞Aβ聚集，進而導致細胞凋亡的發(fā)生；吸入麻醉藥異氟醚對Aβ聚集和神經(jīng)元凋亡的影響與異氟醚暴露濃度、時間、次數(shù)以及動物年齡等多種因素相關；應用1%最低肺泡有效濃度(MAC)為1的異氟醚麻醉12月齡APP695小鼠4 h可導致小鼠Aβ病理性聚集及海馬神經(jīng)元損傷。研究[2]顯示：應用2%的異氟醚麻醉7月齡Tg2576小鼠(麻醉20 min，2次/周) ，可導致10月齡小鼠海馬組織Aβ表達水平明顯增加。然而，Xu等[27]研究顯示：0.5%異氟醚麻醉30 min對AD小鼠神經(jīng)元凋亡無影響。本研究結(jié)果顯示：與常鋅組比較，常鋅+異氟醚組小鼠異氟醚麻醉后6 h海馬神經(jīng)元凋亡率增高，麻醉后24 h海馬神經(jīng)元凋亡率無明顯變化，表明1.4%異氟醚單次、短時間麻醉能夠短暫加重常鋅APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果還顯示：與缺鋅組比較，缺鋅+異氟醚組小鼠麻醉后6和24 h海馬神經(jīng)元凋亡率和Aβ42表達均明顯增高，表明缺鋅可能是吸入麻醉藥異氟醚誘導AD發(fā)病的一個重要風險因素，能夠加劇異氟醚對AD的神經(jīng)毒性作用，促進細胞凋亡。

細胞凋亡的機制尚不十分清楚，可能與線粒體損傷、氧化應激和鈣穩(wěn)態(tài)失衡等多種因素有關聯(lián)。Caspase和Bcl-2家族在線粒體細胞凋亡通路中發(fā)揮著重要作用。Caspase-3具有促進細胞凋亡的作用，是Caspase級聯(lián)反應中凋亡的最終實施因子。Bcl-2家族包括促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2，Bax能與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產(chǎn)生抑制作用，Bax/Bcl-2比值是決定細胞凋亡發(fā)生的關鍵指標[14]。AD時Aβ聚集，能夠增強Bax表達，引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值升高，激活Caspase-3，最終導致細胞凋亡[28]。本研究結(jié)果顯示：與常鋅組比較，缺鋅組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、Bax/Bcl-2比值、Aβ42和Cleaved caspase-3表達水平均升高；而與缺鋅組比較，缺鋅+異氟醚組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、Bax/Bcl-2比值、Aβ42和Cleaved caspase-3表達水平均進一步增加，表明缺鋅能夠加重異氟醚對AD神經(jīng)元損傷，加劇Aβ聚集，激活Bax，抑制Bcl-2，引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值增加，促進Caspase活化，誘導神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，10月齡常鋅APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠給予1.4%異氟醚麻醉2 h能夠短暫加重其海馬神經(jīng)元凋亡；1.4%異氟醚麻醉2 h能夠明顯加重缺鋅APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元凋亡，其機制可能與促進海馬Aβ42聚集、增強Bax表達、抑制Bcl-2表達及激活Caspase-3有關。

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