十全大補(bǔ)湯對(duì)SV40 T抗原轉(zhuǎn)基因小鼠晶狀體自發(fā)腫瘤的抑制作用及其分子機(jī)制

伍繼成，趙 爽，伍 威，楊 雷，丁曉青，鄭華川

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000; 2. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40，SV40)屬瘤病毒科，其基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，全長(zhǎng)5 200 bp，是第一個(gè)完成基因組DNA全序列分析的動(dòng)物病毒[1]。采用α晶狀體球蛋白特異性啟動(dòng)子和SV40 T抗原基因建立了一種晶狀體腫瘤轉(zhuǎn)基因(T antigen transgenic，TG)小鼠模型，使得SV40 T 抗原可以特異性地在晶狀體中表達(dá)，進(jìn)而自主發(fā)生腫瘤[2]，進(jìn)而用于抗腫瘤藥物的體內(nèi)篩選。十全大補(bǔ)湯是一種結(jié)合了10種草本藥物的天然藥物，由南君子湯、四物湯加黃芪和肉桂組成[3]，具有舒養(yǎng)心肝、補(bǔ)脾益氣的功效，并能通過(guò)促進(jìn)粒細(xì)胞集落刺激因子的生成，增強(qiáng)患者免疫力，有效降低重度化療不良反應(yīng)發(fā)生率及緩解慢性疾病疼痛等[4-6]；此外，其已顯示出通過(guò)增強(qiáng)吞噬功能，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[7]。本研究旨在通過(guò)給予SV40 TG小鼠十全大補(bǔ)湯來(lái)研究其潛在的抗腫瘤作用，并通過(guò)氨基酸水平和基因芯片分析探討其對(duì)于肝臟的保護(hù)作用及抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物處理α晶狀體蛋白啟動(dòng)子調(diào)控的SV40 TG小鼠構(gòu)建方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。TG小鼠飼養(yǎng)在SPF動(dòng)物房中，給予相對(duì)恒定的溫度和濕度，12 h 晝夜交替照明。本實(shí)驗(yàn)選取出生3周離乳后的TG小鼠(n=64)，標(biāo)記后隨機(jī)分為對(duì)照組(n=39)和藥物處理組(n=25)，對(duì)照組小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)維持飼料；藥物處理組小鼠給予含1.5%十全大補(bǔ)湯的合成飼料(10.5%黃芪，10.5%人參，10.5%桂皮，10.5%當(dāng)歸，10.5%川芎，10.5%白芍藥，10.5%熟地，10.5%白術(shù)，10.5%茯苓，5.5%甘草)。分別在喂食8和15周時(shí)采集對(duì)照組和藥物處理組TG小鼠血清，取肝臟組織，樣本存儲(chǔ)于-80℃冰箱。

1.2 TG小鼠生存率檢測(cè)出生3周的TG小鼠標(biāo)記后分為對(duì)照組(n=33)和藥物處理組(n=19)，飼養(yǎng)同上，每日早晚各觀察1次，分別記錄每只小鼠生存時(shí)間，并計(jì)算各組小鼠生存率。

1.3 TG小鼠血清氨基酸水平檢測(cè)TG小鼠在喂食十全大補(bǔ)湯8周(對(duì)照組n=3，藥物處理組n=3)和15周(對(duì)照組n=3，藥物處理組n=3)時(shí)，禁食過(guò)夜，尾靜脈采集各組小鼠血液，立即置于冰上，3 000 min-1、4℃離心15 min，抽取上清存儲(chǔ)于-80℃冰箱。血樣解凍后，5%三氯乙酸脫蛋白，10 000 r·min-1、4℃離心15 min，收集上清液通過(guò)再生纖維素膜(美國(guó)密理博公司)過(guò)濾后， 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(MSQ Plus LC/MS 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)各組小鼠血清中氨基酸水平。谷氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸由于在血清中不穩(wěn)定，故排除在外不做檢測(cè)。

1.4 基因芯片雜交含有24 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本的MM8-60mer-expr-X4(NimbleGen)芯片用于肝臟基因表達(dá)分析檢測(cè)。依據(jù)NimbleGen GeneChip?表達(dá)檢測(cè)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品準(zhǔn)備(3只/組)。提取肝臟組織總RNA，利用基因芯片?表達(dá) 3′擴(kuò)增試劑單循環(huán) cDNA 合成試劑盒(美國(guó)昂飛公司)將10 μg 總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。利用Cy3標(biāo)記試劑盒標(biāo)記cDNA (美國(guó)羅氏公司)，然后與基因芯片點(diǎn)陣雜交(42℃、16 h)。清洗芯片，生物芯片掃描儀(NimbleGen)掃描，Subio平臺(tái)(Affymetrix)分析結(jié)果。雜交后有明顯變化的基因吸光度(A)值數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為百分率，利用比較分析檢測(cè)組間基因表達(dá)的改變?；虮磉_(dá)變化達(dá)到或者超過(guò)2倍被認(rèn)為有意義。

1.5 基因網(wǎng)絡(luò)與信號(hào)通路分析將基因編號(hào)輸入國(guó)立變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID)網(wǎng)站的DAVID Bioinformatics Resources 6.7數(shù)據(jù)庫(kù) (http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp)，分級(jí)聚類法研究對(duì)照組和藥物處理組TG小鼠基因表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 2組TG小鼠生存率對(duì)照組TG小鼠平均生存32周，藥物處理組TG小鼠平均生存39周。與對(duì)照組比較，藥物處理組TG小鼠總體生存率明顯提高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 2組TG小鼠的生存率

2.2 2組TG小鼠血清氨基酸水平與對(duì)照組比較，喂食十全大補(bǔ)湯8周時(shí)，藥物處理組TG小鼠血清賴氨酸，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸和羥賴氨酸水平升高(P<0.05)，胱硫醚、?；撬帷⒓谆M氨酸、肌肽和乙醇胺水平降低(P<0.05)。15周時(shí)，與對(duì)照組比較，藥物處理組TG小鼠血清中蘇氨酸和瓜氨酸水平升高(P<0.05)，其他氨基酸水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組TG小鼠血清氨基酸水平

*P<0.05 compared with control group.

2.3 基因芯片雜交法檢測(cè)TG小鼠肝臟基因變化基因芯片雜交結(jié)果分析顯示：喂食十全大補(bǔ)湯后，與對(duì)照組比較，TG小鼠肝組織表達(dá)的9 083個(gè)基因中與核糖體功能相關(guān)的13個(gè)基因發(fā)生改變(P<0.05)；功能分析及基因本體中發(fā)生明顯改變的基因也與核糖體相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)圖2(插頁(yè)一)和表2～4。

表2 藥物處理組TG小鼠肝臟核糖體中發(fā)生明顯改變的基因

Note:e-n=10-n.

表3 藥物處理組TG小鼠肝臟功能分析中發(fā)生明顯改變的基因

Note:e-n=10-n.

表4 藥物處理組TG小鼠肝臟基因本體中發(fā)生明顯改變的基因

3 討 論

α晶狀體蛋白啟動(dòng)子調(diào)控的SV40 T抗原誘發(fā)的晶狀體上皮自發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可通過(guò)觀察動(dòng)物視力和腫瘤大小，初步判斷晶狀體上皮細(xì)胞病變和腫瘤侵襲進(jìn)程，且不影響動(dòng)物生存，不用處死動(dòng)物就可以直接觀察到腫瘤生長(zhǎng)情況。該腫瘤動(dòng)物模型用于抗腫瘤藥物療效篩選，可排除其他環(huán)境致癌物對(duì)篩查抗腫瘤藥物的影響，并且具有操作簡(jiǎn)單、方便和快捷的特點(diǎn)。

十全大補(bǔ)湯是補(bǔ)血保肝的著名方劑，各成分之間相輔相成，對(duì)各種疾病有滋補(bǔ)治療的作用，文獻(xiàn)[9]也較早的報(bào)道了其明顯的抗腫瘤作用。Satoh等[10]研究發(fā)現(xiàn)：十全大補(bǔ)湯可以有效延長(zhǎng)晚期肺癌患者生存期，治療組患者在給予十全大補(bǔ)湯后，血清中6種必需氨基酸水平(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸)升高，而胱硫醚、?；撬?、甲基組氨酸、肌肽和乙醇胺水平降低，與本研究的檢測(cè)結(jié)果一致。研究[11]表明：胱硫醚、?；撬帷⒓谆M氨酸、肌肽和乙醇胺的高表達(dá)與肝臟疾病有密切關(guān)聯(lián)，十全大補(bǔ)湯能有效降低TG小鼠血清中此類氨基酸的水平，可能是其發(fā)揮保肝作用的基礎(chǔ)。必需氨基酸是機(jī)體不能合成而必需從飲食中攝入的氨基酸,可反映動(dòng)物食欲，非必需氨基酸主要由肝臟合成，可反映肝臟功能，TG小鼠喂食十全大補(bǔ)湯后血清中氨基酸水平得到改善。綜合文獻(xiàn)報(bào)道及本研究結(jié)果，本文作者推測(cè)：十全大補(bǔ)湯能促使TG小鼠食欲增加，改善營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，提高肝臟的合成功能，并通過(guò)湯劑中的部分成分緩解腫瘤疼痛，發(fā)揮抑制晶狀體腫瘤的作用，且對(duì)肝臟無(wú)損傷。這一假設(shè)也解釋了藥物治療的小鼠具有更高的生存率的原因。此外，較長(zhǎng)時(shí)間的治療會(huì)導(dǎo)致藥物誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)改善作用消失，這可能與TG小鼠食欲的穩(wěn)定或隨著年齡的增長(zhǎng)肝臟解毒能力的增強(qiáng)有關(guān)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分，其通過(guò)促進(jìn)核糖體RNA折疊而使之處于最利于其執(zhí)行翻譯功能的構(gòu)象狀態(tài)，提高蛋白質(zhì)生物合成的效率和準(zhǔn)確度[12]；此外，核糖體蛋白還存在核糖體外的功能如參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，調(diào)節(jié)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。研究[13-15]顯示：多種核糖體蛋白參與腫瘤的發(fā)生演進(jìn)。核糖體蛋白可通過(guò)調(diào)控癌基因和抑癌基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡，促進(jìn)血管生成，調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)行為?；蛐酒s交結(jié)果顯示：十全大補(bǔ)湯飼養(yǎng)后的TG小鼠肝臟與核糖體功能相關(guān)的基因發(fā)生明顯改變，肝臟顯示出了高水平的蛋白質(zhì)的合成，功能分析和基因本體也同樣證明了這一點(diǎn)。十全大補(bǔ)湯喂食后上調(diào)了TG小鼠的肝臟解毒功能導(dǎo)致高水平的蛋白質(zhì)合成可解釋這種現(xiàn)象，高水平的蛋白質(zhì)合成也可同時(shí)保護(hù)肝臟避免進(jìn)一步的損傷。因此，綜合本研究中氨基酸檢測(cè)和基因芯片雜交結(jié)果推測(cè)：十全大補(bǔ)湯可促進(jìn)TG小鼠肝臟對(duì)部分氨基酸的合成，提高肝臟核糖體蛋白的合成能力，緩解晶狀體自發(fā)腫瘤。

綜上所述，十全大補(bǔ)湯可通過(guò)改善TG小鼠的食欲來(lái)改善其營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，提高血清中必需氨基酸的水平，促進(jìn)肝臟非必需氨基酸及核糖體蛋白的合成能力，在不伴有肝損害的情況下延長(zhǎng)TG小鼠的生存時(shí)間，發(fā)揮抗腫瘤作用。十全大補(bǔ)湯中各成分在該模型中的分子靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

[1] Poulin DL,DeCaprio JA.The carboxyl-terminal domain of large T antigen rescues SV40 host range activity in trans independent of acetylation [J].Virology,2006,349(1):212-221.

[2] 王建平,張梅英,徐小燕,等.JCV病毒T抗原誘發(fā)晶狀體上皮腫瘤動(dòng)物模型建立 [J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,40 (1):27-29.

[3] 任 華，沈 初．觀察十全大補(bǔ)湯聯(lián)合腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)食管癌術(shù)后患者免疫功能的影響[J].新中醫(yī)，2016，48(10)：204-206．

[4] 杜春海,戎瑞雪,王 夢(mèng),等.十全大補(bǔ)湯多糖成分抑瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的初步研究 [J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2014,29(4):3-6.

[5] 唐 妮,十全大補(bǔ)湯對(duì)卵巢癌術(shù)后化療療效的影響及安全性評(píng)價(jià)[J].西南國(guó)防醫(yī)藥,2017,27(7):762-764.

[6] 王本軍，白克運(yùn)，李云霞.結(jié)直腸癌患者術(shù)后服用十全大補(bǔ)湯聯(lián)合化療對(duì)血清TGF-β1水平的影響[J].山東醫(yī)藥，2017,57(10):42-44.

[7] 宋 紅，包素珍，鄭小偉，等.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在Lewis肺癌組織中表達(dá)的意義及十全大補(bǔ)湯對(duì)其干預(yù)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(8):684-687.

[8] Zheng HC,Nakamura T,Zheng Y,et al.SV40 T antigen disrupted the cell metabolism and the balance between proliferation and apoptosis in lens tumors of transgenic mice [J].J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(11):1521-1532.

[9] 劉華巖，王 軍．十全大補(bǔ)湯對(duì)小鼠骨髓源性細(xì)胞向腦內(nèi)遷移的影響[J]．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40(12)：1075-1078.

[10]Satoh H,Ishikawa H,Ohtsuka M,et al.Japanese herbal medicine in patients with advanced lung cancer:prolongation of survival[J].J Altern Complement Med,2002,8(2):107-108.

[11]Ghandforoush-Sattari M,Mashayekhi S.Evaluation of taurine as a biomarker of liver damage in paracetamol poisoning [J].Eur J Pharmacol,2008,581(1/2):171-176.

[12] 田 媛，張俊平.核糖體蛋白質(zhì)的新功能及其與相關(guān)疾病的關(guān)系[J].生命的化學(xué),2011,31(4):488-491.

[13]袁 飛，王樹(shù)斌，王月麗.核糖體蛋白家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用的研究進(jìn)展[J].腫瘤代謝與營(yíng)養(yǎng)電子雜志，2017,4(1):109-112.

[14] 祁岳坤，吳凌云.核糖體蛋白異常與相關(guān)血液疾病[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2016,24(6)：1892-1896.

[15]彭文苗，秦傳蓉，張志敏，等.核糖體蛋白L23參與腫瘤進(jìn)程的研究[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2016,43(11):835-837.