As2O3聯(lián)合γ分泌酶抑制劑MW167對(duì)人肝癌HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的影響

楊 莉，王雪雯，周 明，張 帆

(1．石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2．石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，新疆 石河子 832002)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一。盡管HCC的最佳治療方法是根治性手術(shù)治療，但大多數(shù)患者在明確診斷時(shí)因多種并發(fā)癥已失去手術(shù)指征，大多數(shù)不可切除的HCC患者和已經(jīng)完成手術(shù)治療的患者均需行全身化療。雖然不斷有新的化療方案涌現(xiàn)，但腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的存在既限制了化療效果，也是導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因[1]，因此闡明MDR機(jī)制對(duì)于防治肝癌及其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。研究[2]發(fā)現(xiàn)：三氧化二砷(As2O3)可抑制多藥耐藥人肝細(xì)胞癌R-HepG2細(xì)胞的增殖，且該細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性與親本細(xì)胞的敏感性相似；也有研究[3]顯示：As2O3能夠抑制乳腺癌SKBR-3細(xì)胞Notch-1的表達(dá)及抑制細(xì)胞增殖和遷移。Notch-1基因作為Notch信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵的受體基因在該通路中發(fā)揮著重要的作用[4]。γ分泌酶抑制劑作用于Notch信號(hào)通路的第三部酶切反應(yīng)，從而抑制Notch信號(hào)通路的活化；Hes-1為活化的Notch通路的靶基因，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增殖和分化。Hu等[5]研究發(fā)現(xiàn)：As2O3能夠呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制骨髓瘤細(xì)胞Notch-1受體其下游基因Hes-1的表達(dá)。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，Bcl-2為抗凋亡基因，Bax為促凋亡基因，Bcl-2和Bax比例失衡在腫瘤發(fā)生和腫瘤耐藥過程中可能發(fā)揮重要作用，采用As2O3處理Saos-2阿霉素(ADM)耐藥細(xì)胞后Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)水平下調(diào)，Bax表達(dá)水平上調(diào)[6]。本研究擬探討As2O3和MW167(γ分泌酶抑制劑)對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的影響及其作用機(jī)制，為闡明As2O3和Notch-1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2/ADM細(xì)胞耐藥的相關(guān)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑和儀器人肝癌HepG2/ADM細(xì)胞株購自中國廣州吉賽生物科技有限公司，在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素(美國HyClone公司)及0.1 mg·L-1ADM(深圳萬樂藥業(yè)股份有限公司)的高糖DMEM(美國Gibco公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前1周去除含ADM的培養(yǎng)基，改為普通培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)中孵育，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。As2O3(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)，γ分泌酶抑制劑Ⅱ MW167(德國Merck公司)，二甲基亞砜(DMSO)和5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國Sigma公司)，兔抗人單克隆抗體Notch-1(#4380s)、Hes-1(#11988s)、MDR-1(#13342s)、Bcl-2(#2870s)和Bax(#5023s)(美國CST公司)，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國Thermo公司)，內(nèi)參β-actin和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)，常規(guī)生物化學(xué)試劑(新疆寶信生物公司)。一次性細(xì)胞培養(yǎng)器材購自美國Corning公司，PCR儀(日本TaKaRa公司)，倒置熒光相差顯微鏡IX71(日本OLYMPUS公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)，凝膠成像儀(GEL-DOC 2000，美國Bio-Rad公司)。

1.2 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長期HepG2/ADM細(xì)胞，以 1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng) 24 h后，使細(xì)胞暴露在不同濃度的As2O3和 MW167中，As2O3終濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8.00 mg·L-1，MW167終濃度分別為10、20和40 μmol·L-1，同時(shí)設(shè)對(duì)照孔和調(diào)零孔，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加藥后分別培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，37℃避光孵育4 h，棄上清液后，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀中速震蕩10 min，測(cè)定490 nm處的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞抑制率=[1-(Ax-A)/(A0-A)]×100%(Ax為加藥孔A值，A0為空白孔A值，A為調(diào)零孔A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取細(xì)胞增殖抑制率<15%的藥物濃度為該藥的無細(xì)胞毒性濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組將HepG2/ADM細(xì)胞分為空白組、As2O3組、MW167組和As2O3與MW167聯(lián)合組。細(xì)胞以1×106個(gè)/皿接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇無細(xì)胞毒劑量藥物(抑制率<15%)，即0.25 mg·L-1As2O3和10 μmol·L-1MW167單獨(dú)和聯(lián)合處理各組細(xì)胞48 h后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取加藥干預(yù)48 h后的各組細(xì)胞，按Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用自帶FACSDiva Version 6.1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、MDR-1、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并鑒定，引物上下游序列和產(chǎn)物大小見表1。采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，納微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度，按照RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，GADPH為內(nèi)參，用RT-PCR試劑盒對(duì)mRNA進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。cDNA擴(kuò)增完成后取其產(chǎn)物10 μL行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像儀成像并拍照，Image Lab軟件檢測(cè)條帶并進(jìn)行A值分析。目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量=目的基因A值/GADPH基因A值。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物大小

1.6 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、P-gp、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平采用RIPA法提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性8 min；取20 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE (8%～10% 分離膠、5% 濃縮膠)；將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5% 脫脂奶粉封閉1 h，棄封閉液，加入相應(yīng)抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；次日，TBST洗膜后加入二抗(1∶20 000～1∶50 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，進(jìn)入暗室壓片，顯影，定影。用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Image Lab軟件對(duì)檢測(cè)條帶進(jìn)行灰度值掃描，Gel-Pro Analyzer 4 軟件進(jìn)行分析。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度As2O3和 MW167作用后HepG2/ADM細(xì)胞增殖抑制率不同濃度As2O3和 MW167均可不同程度抑制HepG2/ADM細(xì)胞的增殖；在同一濃度時(shí)，As2O3和MW167對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖抑制率隨作用時(shí)間的延長而升高(P<0.05或P<0.01)；在同一時(shí)間點(diǎn)， As2O3和MW167對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖抑制率隨藥物濃度的增加而升高(P<0.05或P<0.01)。見圖1。0.25 mg·L-1As2O3和10 μmol·L-1MW167作用HepG2/ADM細(xì)胞48 h后增殖抑制率為(14.4±2.54)% 和(13.6±1.08)%；在抑制率<15%前提下，As2O3和MW167作用24 h對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用較弱；在72 h時(shí)，其抑制率>15%。故本實(shí)驗(yàn)后期選定藥物干預(yù)細(xì)胞時(shí)間為48 h，確定As2O3干預(yù)細(xì)胞濃度為0.25 mg·L-1，MW167干預(yù)細(xì)胞濃度為 10 μmol·L-1。

2.2 各組HepG2/ADM細(xì)胞凋亡率As2O3組和MW167組細(xì)胞凋亡率分別為(36.2±0.65)%和(42.6±0.70)%，均高于空白組[(4.43±0.21)%](P<0.05)，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率為(52.1±0.32)%，明顯高于空白組、As2O3組和MW167組(P<0.01)。見圖2。

n=3; *P<0.05,**P<0.01 compared with 24 h; △P<0.05,△△P<0.01 compared with 48 h.

A:Blank group; B:As2O3 group; C:MW167 group; D:Combination group.

2.3 RT-PCR法檢測(cè)各組HepG2/ADM細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、MDR-1、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平藥物干預(yù)HepG2/ADM細(xì)胞48 h后，與空白組比較，As2O3組和MW167組細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、MDR-1和Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平均降低(P<0.05)，Bax mRNA 表達(dá)水平升高(P<0.05)；與空白組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、MDR-1和Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，Bax mRNA 表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見圖3和表2。

M:DNA marker; Lane 1:Blank group; Lane 2:Combination group; Lane 3:MW167 group; Lane 4:As2O3 group.

表2 各組HepG2/ADM細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、MDR-1、Bcl-2 和Bax mRNA表達(dá)水平

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank group.

2.4 Western blotting法檢測(cè)各組HepG2/ADM細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、P-gp、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平藥物干預(yù)HepG2/ADM細(xì)胞48 h后，與空白組比較，As2O3組和MW167組細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、P-gp和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與空白組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、P-gp和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見圖4和表3。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞MDR機(jī)制很多，其中以細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少、細(xì)胞內(nèi)解毒酶活性增高、細(xì)胞凋亡減少及TopoⅡ水平下降引起的細(xì)胞耐藥最常見，以P-gp作為藥物外流泵而引起藥物外流是耐藥性產(chǎn)生的主要原因[7]。目前，探索腫瘤的耐藥機(jī)制、尋求低毒高效的化療藥物及實(shí)施聯(lián)合用藥已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

Lane 1:Blank group; Lane 2:Combination group; Lane 3:MW167 group; Lane 4:As2O3 group.

表3 各組HepG2/ADM細(xì)胞中Notch-1、Hes-1、P-gp、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank group.

As2O3是中國最古老的毒物之一，作為藥物應(yīng)用已有2 400多年的歷史[8]。20世紀(jì)70年代，我國學(xué)者首次提出As2O3具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化的作用，可有效治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)。大量研究[9-12]顯示：As2O3對(duì)實(shí)體腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、宮頸癌和多發(fā)性骨髓瘤等，也有誘導(dǎo)凋亡或抑制增殖的作用。近年來對(duì)As2O3抗腫瘤機(jī)制的研究[13-15]顯示：As2O3可以提高化療耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，但是具體機(jī)制并無統(tǒng)一定論，可能是降低耐藥蛋白的表達(dá)或誘導(dǎo)凋亡抑制腫瘤細(xì)胞生長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：As2O3能有效抑制HepG2/ADM細(xì)胞的增殖，并且其抑制作用呈劑量-時(shí)間依賴性；同時(shí)凋亡實(shí)驗(yàn)顯示：As2O3能提高HepG2/ADM細(xì)胞的凋亡率；As2O3可降低HepG2/ADM細(xì)胞中耐藥基因MDR-1及其蛋白P-gp的表達(dá)，且降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，升高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。已有研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：As2O3可通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和下調(diào)P-gp的表達(dá)，有效地逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性。

Notch信號(hào)的活化是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用，Notch受體經(jīng)過3次酶切，經(jīng)γ分泌酶復(fù)合體酶切釋放Notch受體胞內(nèi)區(qū)(NICD)，NICD依附特異性DNA結(jié)合蛋白定位于細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物CSL結(jié)合，隨后導(dǎo)致Notch典型的靶基因的活化：myc、P21和 Hes家族成員[16-17]。許多腫瘤的發(fā)生與該信號(hào)通路的異常激活有關(guān)。近年來，關(guān)于Notch信號(hào)通路與腫瘤耐藥的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)。Rizzo等[18]證實(shí)：通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)或γ分泌酶抑制劑下調(diào)Notch-1活性可潛在地增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性。Meng等[19]發(fā)現(xiàn)：抑制Notch-1 活性能增加結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW620對(duì)奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶以及伊立替康的化療敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究選用Notch通路抑制劑MW167作用于HepG2/ADM細(xì)胞，結(jié)果顯示：MW167能明顯抑制HepG2/ADM細(xì)胞的增殖，并且其抑制作用呈時(shí)間-劑量依賴性；凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明MW167可提高HepG2/ADM細(xì)胞的凋亡率，且MW167可降低HepG2/ADM細(xì)胞中Notch-1、Hes-1和MDR-1(P-gp)mRNA及蛋白的表達(dá)。研究[20]顯示：As2O3能抑制急性淋巴細(xì)胞白血病Mol-4細(xì)胞的增殖，下調(diào)Notch-1基因和蛋白的表達(dá)，降低Bcl/Bax蛋白比例，并促進(jìn)凋亡蛋白caspase-3的活化。本研究結(jié)果顯示：As2O3降低了HepG2/ADM細(xì)胞中Notch-1和Hes-1、MDR-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，As2O3聯(lián)合MW167干預(yù)HepG2/ADM細(xì)胞后下調(diào)細(xì)胞中Notch-1、Hes-1和MDR-1(P-gp)mRNA及蛋白的表達(dá)水平更明顯。本研究結(jié)果證明：Notch-1信號(hào)通路的異常激活參與了HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，抑制Notch-1通路能有效抑制HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性；As2O3逆轉(zhuǎn)耐藥可能與Notch-1信號(hào)通路存在共同通路。

Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)凋亡的原癌基因，包括抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bfl-1和Mcl-1等以及促凋亡成員Bax、Bak、Bok、Bad、Bid和Bik等[21]。Bcl-2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白比例失衡在腫瘤發(fā)生和腫瘤耐藥過程中可能發(fā)揮重要作用。Lin等[22]發(fā)現(xiàn)：將促凋亡基因Bax轉(zhuǎn)染高表達(dá)Bcl-2和Bcl-xL的卵巢癌耐藥細(xì)胞，可使細(xì)胞凋亡增加。在As2O3對(duì)大鼠HCC作用的研究[23]中發(fā)現(xiàn)：Bcl-2或Bax的表達(dá)水平隨As2O3的劑量變化而變化，Bcl-2/Bax的下調(diào)伴隨凋亡的上調(diào)。本研究結(jié)果顯示：As2O3和MW167均能降低HepG2/ADM細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，增加Bax mRNA和蛋白的表達(dá)水平；As2O3聯(lián)合MW167干預(yù)HepG2/ADM細(xì)胞后顯示：聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯高于單藥組,且聯(lián)合組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低更明顯，Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平升高更明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：As2O3和MW167可通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族引起HepG2/ADM細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，As2O3能有效逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性，且此過程與Notch-1通路有密切關(guān)聯(lián)。但本研究是基于體外細(xì)胞水平的研究，缺乏全面代表性；另外，Notch-1通路只是Notch通路的一部分，對(duì)其他通路與肝細(xì)胞癌耐藥的影響缺乏研究。As2O3通過Notch-1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性還需要進(jìn)行大量臨床實(shí)驗(yàn)研究，以期為肝癌的治療提供更加全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。

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