水貂阿留申病診斷技術(shù)的進(jìn)展

李 俚, 胡 哲, 孫金輝, 關(guān)東嵩, 方孟頎, 王曉鈞, 路義鑫

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱150030 ;2.哈爾濱海關(guān), 黑龍江 哈爾濱150028 ;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱150069 ;4.大慶海關(guān), 黑龍江 大慶163311)

水貂阿留申病(AMD)是由水貂阿留申病毒(AMDV)引起的一種能夠引起自身免疫紊亂的慢性進(jìn)行性傳染病。 引起該病的病毒可感染各個(gè)年齡段的水貂,依據(jù)感染毒株類型的不同,病癥呈多樣性。 對(duì)新生仔貂而言,AMDV 引起的死亡率幾乎可達(dá)到100%;而對(duì)于成年水貂,該病通常引起水貂的持續(xù)感染,并表現(xiàn)為終生病毒血癥、高蛋白血癥、動(dòng)脈血管炎和由病毒-抗體復(fù)合體誘導(dǎo)的腎小球腎炎及肝炎等。

臨床上還沒(méi)有能夠防治AMD 的有效疫苗和藥物,因此目前防控該病的手段主要為水貂新引入前的檢疫、場(chǎng)址的徹底消毒,以及感染貂群中病畜的撲殺。 大多數(shù)情況下,水貂感染AMD 后沒(méi)有典型的臨床癥狀,確診主要依賴于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)。 本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外AMD 的主要診斷方法及特點(diǎn)進(jìn)行綜述,以期為新水貂引入前的檢疫、環(huán)境消毒效果的評(píng)價(jià)及感染貂場(chǎng)AMD 的防控提供方法依據(jù)。

1 AMDV 的血清學(xué)檢測(cè)方法

1.1 碘凝集試驗(yàn)(IAT) IAT 是1962 年由Henson等[1]最先用于鑒別AMD 的血清學(xué)方法。 因該方法成本低廉、操作簡(jiǎn)單,所以很容易被推廣。 但水貂感染AMDV 后產(chǎn)生的丙種球蛋白水平通常需要1個(gè)月的時(shí)間才能被檢測(cè)到,因此IAT 不適用于AMD初期感染的檢測(cè)。 另外,IAT 為非特異性試驗(yàn),對(duì)能夠產(chǎn)生高丙種球蛋白血癥的其他慢性疾病,如結(jié)核病和腎病等同樣可以發(fā)生反應(yīng),所以單純使用該法無(wú)法達(dá)到根除AMD 的目的,目前IAT 已很少被規(guī)?；乃躔B(yǎng)殖場(chǎng)采用。

1.2 對(duì)流免疫電泳(CIEP) CIEP 作為特異性檢測(cè)抗AMDV 抗體的血清學(xué)方法,最早的使用是在20世紀(jì)70 年代,而后成為了AMD 防控的重要診斷技術(shù)并在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。 Farid 等[2]于1998 -2005 年對(duì)加拿大新斯科舍省AMD 的流行情況進(jìn)行了調(diào)查,對(duì)比了用CIEP 方法對(duì)AMD 進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)(發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性動(dòng)物并剔除)、間斷監(jiān)測(cè),以及從不檢測(cè)的農(nóng)場(chǎng)的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果顯示,持續(xù)監(jiān)測(cè)的23 個(gè)農(nóng)場(chǎng)的CIEP 平均陽(yáng)性率為2.2%,且其中的2個(gè)農(nóng)場(chǎng)在后4 年始終保持為全群CIEP 結(jié)果陰性;間斷監(jiān)測(cè)的33 個(gè)農(nóng)場(chǎng)的平均陽(yáng)性率為8.55%;而2個(gè)從不檢測(cè)農(nóng)場(chǎng)的陽(yáng)性率分別為75.8%和84.6%。這表明使用CIEP 對(duì)陽(yáng)性個(gè)體及時(shí)淘汰的策略對(duì)降低感染水貂數(shù)量有明顯效果,但不能做到絕對(duì)的根除。 戚永娜等[3]在2014 -2015 年通過(guò)IAT 和CIEP兩種試驗(yàn)方法對(duì)山東紅島地區(qū)的30 只45 日齡水貂進(jìn)行了AMD 感染情況調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIEP 法的陽(yáng)性檢出率為63.33%,而IAT 法的檢出率為0,進(jìn)一步證實(shí)了CIEP 在特異性和敏感性方面要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于IAT。

1.3 ELISA 方法 在歐洲,AMDV 的抗體檢測(cè)已被列入一些水貂養(yǎng)殖國(guó)家的國(guó)家性根除計(jì)劃。 僅就丹麥而言,每年都有約400 萬(wàn)計(jì)的水貂樣品需要進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。 為了能夠降低人力成本,使AMD的檢測(cè)更適于自動(dòng)化操作,ELISA 方法逐漸建立起來(lái)。 目前在北歐國(guó)家普遍使用的ELISA 主要有兩種,一種是基于AMDV-G 抗原的;另一種是基于重組AMDV-VP2 抗原的。 Dam-Tuxen 等通過(guò)對(duì)2 436份水貂樣品檢測(cè),將AMDV-GELISA 同CIEP 的檢測(cè)性能進(jìn)行比較,證明了AMDV-G ELISA 比CIEP 的敏感性高,但特異性低。 Andersson 等[5]以CIEP 為“金標(biāo)準(zhǔn)”比較了兩種ELISA 方法的檢測(cè)性能。 結(jié)果顯示,AMDV-G ELISA 的敏感性為54.3%,特異性為93.2%;而AMDV-VP2 ELISA 的敏感性和特異性分別是99.7%和98.3%,在檢測(cè)性能方面可完全取代CIEP。 與之相比,中國(guó)學(xué)者Chen 等用重組的VP2 核心抗原片段VP2332-452蛋白為抗原建立了ELISA;Ma 等[7]用表位預(yù)測(cè)方法選擇并合成了氨基酸序列為aa415 ～aa433 的短肽建立了ELISA。 這兩種基于抗原表位理論建立的ELISA 方法在臨床樣品的應(yīng)用中被證實(shí),在敏感性和特異性方面均比CIEP 優(yōu)越。 李晶等[8]用重組AMDV-VP2 作為抗原建立了Dot-ELISA 方法,在78 份臨床樣品的檢測(cè)中,Dot-ELISA 的檢出率為84.6%,CIEP 的檢出率為80.8%,證明了建立的Dot-ELISA 要比CIEP 更敏感。 王元智等[9]用重組AMDV-VP2 為抗原制備了鼠源的單克隆抗體,并建立了雙抗夾心ELISA 檢測(cè)方法。 此外,在國(guó)內(nèi)的早期報(bào)道中,吳威等[10]曾用AMDV-G 感染CRFK 細(xì)胞,建立了PPA-ELISA 檢測(cè)方法,經(jīng)證明其敏感性要比CIEP 高16 倍以上,但由于該實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)室條件要求高,操作復(fù)雜,所以沒(méi)有應(yīng)用到實(shí)際檢測(cè)中。

1.4 免疫膠體金 為了便于農(nóng)戶自行檢測(cè)水貂的患病情況,徐磊[11]以原核表達(dá)的AMDV-VP2 的主要抗原區(qū)作為檢測(cè)抗原,研制出了AMDV 膠體金快速診斷試紙,其敏感性是CIEP 的2 倍以上。 這種方法的優(yōu)勢(shì)是不需要儀器設(shè)備,易學(xué)易懂,易于在基層推廣。 但該方法中的膠體金顆粒易與帶有正電荷蛋白發(fā)生非特異性的結(jié)合引起假陽(yáng)性,從而使結(jié)果不準(zhǔn)確。

2 AMDV 的病原學(xué)檢測(cè)方法

2.1 普通PCR 方法 普通PCR 是目前為止在AMDV 檢測(cè)方面應(yīng)用最廣泛的病原學(xué)檢測(cè)方法。 該方法通常是在AMDV 的NS1 基因或VP2 基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,通過(guò)對(duì)樣品中可能存在的目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,以達(dá)到檢測(cè)AMDV 的目的。 1996年,Oie 等在對(duì)AMD 通過(guò)浣熊進(jìn)行傳播的研究中,根據(jù)VP2 基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物。 自此以后,國(guó)內(nèi)外很多有關(guān)AMDV 檢測(cè)的文獻(xiàn)中均提到了這對(duì)引物。Jensen 等根據(jù)AMDV 的NS1 基因建立了PCR 方法,并在2008 -2010 年,通過(guò)對(duì)水貂組織樣品同時(shí)進(jìn)行PCR 與CIEP 方法的檢測(cè),證實(shí)了CIEP 方法存在“假陰性”的可能。 Farid 等[14]在對(duì)加拿大新斯科舍省的12 種皮毛動(dòng)物感染AMDV 的患病率開展調(diào)查時(shí),發(fā)現(xiàn)有6 種動(dòng)物存在PCR 或CIEP 陽(yáng)性結(jié)果,該結(jié)果表明AMDV 可在毛皮動(dòng)物間引起流行,對(duì)養(yǎng)殖水貂及易感野生動(dòng)物存在威脅。 國(guó)內(nèi),許秋等[15]基于NS1 基因建立的PCR 方法能夠檢測(cè)到病毒的最低限量為2.53 ng/μL,在對(duì)30 份水貂樣品檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)PCR 檢出率為90%,而用CIEP 方法,檢出率為83%。 邵西群等[16]利用CIEP 和PCR 方法對(duì)自然感染2 年的貂場(chǎng)進(jìn)行AMD 的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在早期感染的水貂及不產(chǎn)生抗體的AMDV 攜帶者中,CIEP 結(jié)果存在“假陰性”,進(jìn)而解釋了利用CIEP 方法根除AMDV 計(jì)劃失敗的原因。 此外,楊瑞梅等[17]將膠體金顆粒加入PCR 體系中建立了AMDV的納米PCR 檢測(cè)方法,該方法可對(duì)含有低毒量的糞尿樣品進(jìn)行檢測(cè),且敏感性是普通PCR 的10 倍。馬芹等[18]使用DNA/RNA 提取試劑盒和一步法擴(kuò)增試劑盒建立了多重PCR,該方法可對(duì)AMDV、水貂病毒性腸炎病毒和犬瘟熱病毒的單一或混合感染的樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),這在實(shí)際水貂疫病防控過(guò)程中大大降低了工作量,節(jié)約了檢測(cè)成本。

2.2 熒光定量PCR(qPCR) qPCR 是在普通PCR基礎(chǔ)上加入了能夠與DNA 雙鏈特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記探針或熒光染料,利用累積的熒光信號(hào)量達(dá)到定量的目的。 具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。 國(guó)外對(duì)qPCR 的報(bào)道較少。 2014 年Bowman 等[19]在對(duì)安大略地區(qū)水獺感染AMDV 的情況進(jìn)行調(diào)查時(shí),使用了基于SYBRGreen 染料的qPCR,但該qPCR 的引物是由Oie 在1996 年設(shè)計(jì)的。 Prieto 等在調(diào)查AMDV 在環(huán)境中的分布時(shí),使用了基于NS 基因的Taq Man 定量PCR 試劑盒,然而有關(guān)該qPCR 的引物和探針序列的信息并沒(méi)有提到。 我國(guó)學(xué)者張秀麗等[22]用SYBRGreenI 染料建立了染料法的qPCR,該方法的敏感性為10 拷貝/μL。 隨后,賈赟等[23]根據(jù)AMD-VP2 基因,用MGB 探針建立了Taq Man 熒光定量PCR,臨床檢測(cè)40 份樣品,陽(yáng)性率為52.5%,比普通PCR 的檢出率高出了7.5%。 qPCR 方法因具有極高的靈敏性,所以在實(shí)際應(yīng)用中更適用于水貂養(yǎng)殖場(chǎng)區(qū)消毒后的效果評(píng)價(jià)和在無(wú)AMD 疫病水貂引入前對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中可能含有AMDV 的檢測(cè)。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法 LAMP檢測(cè)方法是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法,是利用鏈置換DNA 聚合酶,在恒溫條件下,通過(guò)多條靶基因的特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的。 田國(guó)寧等[24]基于AMDV-VP2 基因建立了LAMP 檢測(cè)方法。 采用該方法的顯色法檢測(cè)時(shí),當(dāng)樣品DNA 含量為10 拷貝/μL 仍可通過(guò)肉眼觀察到檢測(cè)結(jié)果。 張卓[25]通過(guò)在反應(yīng)體系中添加熒光指示劑建立了可視化LAMP。通過(guò)與普通PCR 比較,敏感性高達(dá)100 倍。 該方法用時(shí)少,檢測(cè)成本低,并且不需要昂貴的設(shè)備,在AMDV 檢測(cè)的基層推廣中有著良好的前景。

2.4 基因檢測(cè)芯片技術(shù) 朱善元等[26]根據(jù)探針?lè)聪嚯s交技術(shù),利用基因芯片、核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)及酶聯(lián)顯色技術(shù)的原理制成了能夠檢測(cè)AMDV 的基因檢測(cè)芯片。 應(yīng)用該方法對(duì)160 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),陽(yáng)性檢出率為51.25%,比平行檢測(cè)的Dot-ELISA試劑盒的檢出率高17%。 該方法適合對(duì)患病早期、抗體水平產(chǎn)生不高的AMD 感染動(dòng)物的確診。

3 展望

綜上所述,ELISA 具有敏感性高且可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的特點(diǎn),在丹麥、芬蘭等國(guó)家該方法目前已取代CIEP 作為官方指定AMD 檢測(cè)方法。 但就診斷的準(zhǔn)確性來(lái)講,病原學(xué)檢測(cè)方法可直接檢測(cè)到樣品中存在的病原體,不受AMDV 早期感染和潛伏感染的影響。 如不考慮該方法經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本因素,用血清學(xué)方法結(jié)合PCR 方法有可能實(shí)現(xiàn)一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)AMDV 的根除。 盡管qPCR 同其他檢測(cè)方法相比成本相對(duì)較高,但因其具有極高的靈敏性所以更適用于對(duì)AMD 傳播途徑的研究和對(duì)水貂養(yǎng)殖環(huán)境的評(píng)價(jià)。

目前,AMDV 的感染在我國(guó)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)中已呈普遍存在趨勢(shì)。 盡管成年貂患病后很少死亡,但AMD 能增加母貂的空懷率,使仔貂死亡率增高,降低毛皮品質(zhì),從而給水貂產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失并危害著水貂業(yè)的健康發(fā)展。 因此,根據(jù)不同規(guī)模水貂場(chǎng)的養(yǎng)殖條件及防疫需求合理選擇一種或綜合選擇幾種可靠的診斷方法對(duì)該病的防控具有重要的意義。