阿爾茨海默病模型大鼠腦海馬內(nèi)MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達(dá)

張 美 狄婷婷 徐樹雷 趙 夢(mèng) 王瑞婷

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

阿爾茨海默病(AD)的特征表現(xiàn)為患者大腦皮層和海馬區(qū)的老年斑(SP)形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)及神經(jīng)元丟失和凋亡〔1，2〕。目前，國(guó)內(nèi)外研究總體認(rèn)為Aβ是該病的使動(dòng)因子，常以腦內(nèi)注射Aβ的方法來制作AD動(dòng)物模型〔3，4〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族參與了許多疾病的病理生理過程，如心腦血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、腹主動(dòng)脈瘤形成及細(xì)胞凋亡等〔5～7〕。MMPs在體內(nèi)以無活性酶原形式存在，當(dāng)存在鈣/鋅時(shí)，產(chǎn)生活性并作用于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，使基質(zhì)降解〔8〕。研究表明AD患者血清MMP-9水平升高，推測(cè)與AD疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，有可能為AD診斷提供參考〔9〕。內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是MMPs的天然抑制因子〔10〕，TIMP-1活性最強(qiáng)，可特異性抑制MMP-9的活性。另外TIMPs還具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣作用，能使ECM沉積并抑制其降解〔11〕。本實(shí)驗(yàn)探討AD病模型中兩者mRNA的水平。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器 選擇雄性30只Wistar大鼠，10～12周齡，體重(250±20)g，SPF級(jí)別，動(dòng)物合格證號(hào)：0289310，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001〕。主要試劑：Aβ25～35購自Sigma公司，高效液相色譜法檢測(cè)純度≥97%，Aβ25～351 mg干粉加500 μl無菌生理鹽水，制成母液2 g/L，-20℃冷凍存貯。臨用前，37℃溫箱孵育1 w，成凝聚態(tài)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit，RR820A，Lot：AK4505)，RNAiso Plus(9108Q，Lot：AK7602)，DEPC處置水(9013A，Lot：AA1801A)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，Lot：AK3701)，購自大連寶生物工程有限公司；引物的合成由TaKaRa公司提供；腫瘤壞死因子(TNF)-α(EK3822，Lot：238231215)、白細(xì)胞介素(IL)-1β(EK301B2，Lot：2301B30241)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，其他試劑為分析純。第二軍醫(yī)大學(xué)的江灣Ⅰ型腦立體定位儀，瑞士Hamilton公司的微量進(jìn)樣器，瑞士Mettler Toledo公司的AG245型電子分析天平，德國(guó)Startorius公司的BP211D精密電子天平，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司的DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司的MDF-192型超低溫冰箱(-80℃)、低溫冰箱(-20℃)、SIM-F124型制冰機(jī)，德國(guó)Sigma公司的3-16PK冷凍離心機(jī)，美國(guó)Agilent 公司的Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 選取30只成年雄性Wistar 大鼠，按體重編號(hào)1～30，隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組6只。分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料。A組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射無菌生理鹽水5 μl(即Aβ25～350 μg)，B、C、D、E組大鼠分別注射Aβ25～355 μl(分別含Aβ25～350.5、1.0、5.0、10.0 μg)，注射Aβ 14 d。

1.2.2制作AD模型 大鼠4%水合氯醛溶液麻醉后，將其固定在江灣Ⅰ型腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行腦立體定位海馬CA1區(qū)，按預(yù)試驗(yàn)確定進(jìn)針點(diǎn)進(jìn)針，在10 min內(nèi)用微量注射器向雙側(cè)海馬緩慢注入Aβ25～35或生理鹽水5 μl，留針5 min，緩慢拔針，縫合皮膚傷口，術(shù)后注射青霉素抗感染。

1.2.3血清制備及指標(biāo)檢測(cè) 注射藥物或生理鹽水最后1 d，各組大鼠心臟取血于促凝離心管，室溫靜置0.5 h，2 500 r/min，10 min收集上清凍存-80℃冰箱。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在30 min之內(nèi)用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線，計(jì)算標(biāo)本TNF-α、1L-1β含量。

1.2.4引物的設(shè)計(jì)與合成 以β-actin為內(nèi)參照，在GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)查找MMP-9、TIMP-1的基因序列，利用Primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過GenBank BLAST檢測(cè)同源性，設(shè)計(jì)出的引物分別由TaKaRa公司合成。β-actin正義鏈5′-TGACAGGAT GCAGAAGGAGA-3′，反義鏈5′-TAGAGCCACCAATCC ACACA-3′；MMP-9正義鏈5′-CGCTGACAAGAAGTGG GGTTT-3′，反義鏈5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTAT G-3′；TIMP-1正義鏈5′-CCTGGTTCCCTGGCATAATC-3′，反義鏈5′-CGCTCTGGTAGCCCTTCTC-3′。

1.2.5RNA的提取與轉(zhuǎn)錄 取血后，大鼠左心室快速灌注生理鹽水250 ml，然后灌注含4%多聚甲醛的磷酸鹽酸緩沖液(PBS-T)250 ml先快后慢，1 h后斷頭取腦內(nèi)海馬，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取，紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)RNA純度，要求波長(zhǎng)在260/280處吸光值為1.8～2.2。嚴(yán)格按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6Syber Green熒光定量PCR檢測(cè) 應(yīng)用TaKaRa公司提供的實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，總反應(yīng)體系25 μl，上下游引物各10 μl(10 μmol/L)，Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μl，DEPC水8.5 μl，最后加樣品cDNA 2 μl，混勻，離心，置熒光定量PCR儀中，預(yù)變性95℃，30 s，變性95℃，5 s，退火溫度MMP-9(51℃)、TIMP-1(48℃)，延伸72℃ 30 s，收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。采用SYBR法對(duì)MMP-9和TIMP-1 mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7結(jié)果分析 擴(kuò)增完畢，記錄結(jié)果CT值，利用2-△△CT方法進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組TNF-α、IL-1β水平比較 血清TNF-α含量D組(568.65±44.66)ng/L、E組(685.06±29.92)ng/L明顯高于A組(426.87±55.91)ng/L、B組(432.99±28.09)ng/L、C組(488.14±39.04)ng/L(均P<0.01)，且A、B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A組明顯低于C組(P<0.05)，D組明顯低于E組。血清IL-1β含量D組(104.60±9.32)ng/L、E組(143.38±17.09)ng/L明顯高于A組(49.13±8.46)ng/L、B組(60.89±14.71)ng/L、C組(79.81±9.94)ng/L(P<0.01)，且C組明顯高于A組(P<0.01)，D明顯低于E組(P<0.05)。

2.2各組MMP-9、TIMP-1 mRNA水平比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，MMP-9 mRNA表達(dá)D組(4.269 6±1.489 1)、E組(7.801 6±1.258 3)明顯高于B組(1.469 6±0.308 2)、C組(1.837 1±0.412 2)和A組(1.000 0±0.000 0)，D組明顯低于E組(P<0.01)，A、B、C三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TIMP-1 mRNA表達(dá)D組(3.453 0±0.892 6)、E組(5.526 9±1.371 7)組明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.131 4±0.114 3)和C組(1.390 5±0.141 9)(P<0.01)，D組明顯低于E組(P<0.01)，A、B、C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)制作經(jīng)典癡呆模型，炎癥因子TNF-α、IL-1β明顯升高，證實(shí)癡呆模型制作成功。AD主要是Aβ在神經(jīng)元附近聚集形成SP，胞內(nèi)產(chǎn)生纖維纏結(jié)，tau蛋白磷酸化，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并且釋放炎癥因子，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。因此降解Aβ使其在大腦中的堆積減少對(duì)緩解AD有著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MMP對(duì)機(jī)體不同組織的發(fā)育和修復(fù)、腫瘤發(fā)生發(fā)展，尤其在炎癥反應(yīng)中起重要作用〔12，13〕。MMP-9的作用底物是Ⅳ膠原、纖連蛋白、層黏連蛋白等〔14〕，因此預(yù)測(cè)對(duì)AD患者腦內(nèi)堆積的Aβ沉積有一定的降解功能。MMP-9在胞外可被特定的蛋白酶TIMP-1特異性結(jié)合。TIMP-1作為MMP-9的特異性內(nèi)源抑制因子，在生理?xiàng)l件下和MMP-9形成1∶1的復(fù)合物，并切割MMP-9使其被激活。本實(shí)驗(yàn)顯示MMP-9與TIMP-1之間存在動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，且隨著Aβ濃度增加，兩者mRNA的表達(dá)含量都不斷增加。當(dāng)Aβ達(dá)到5.0 μg和10.0 μg濃度時(shí)，MMP-9、TIMP-1 mRNA水平明顯升高，推測(cè)兩者可能參與到Aβ25～35所致的大鼠模型炎性反應(yīng)中，并且根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)推測(cè)MMP-9對(duì)胞外的Aβ進(jìn)行一定程度上降解。具體降解量在什么水平，還要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)表明MMP-9和TIMP-1確實(shí)在AD中有相應(yīng)的改變，即隨Aβ劑量增大，表達(dá)逐漸增加，但是否可作為診斷AD的特征指標(biāo)，還有待進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)的不足是AD模型的建造雖屬于經(jīng)典造模方法，但由于對(duì)動(dòng)物注射Aβ的行為也會(huì)造成腦組織局灶性穿透性損傷，且Aβ聚集于注射位點(diǎn)而不是彌散于腦內(nèi)〔15〕，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析也會(huì)造成一定誤差，因此操作技術(shù)還需進(jìn)一步完善。

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