犬用益生菌研究進(jìn)展

徐春晗，徐鳳宇，許祺珺

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

1947年蒙哈德首次將乳酸菌應(yīng)用于動物飼料中，用來增加仔豬體重并改善仔豬身體健康[1]。20世紀(jì)70年代，美國開始使用飼用微生物作為飼料添加劑[2]。20世紀(jì)80年代初，康白教授使用其研制的促菌生防治仔豬下痢[3]，中國畜牧養(yǎng)殖關(guān)于益生菌制劑的革命由此掀開了序幕。隨著益生菌制劑的發(fā)展，其在畜牧業(yè)中的運(yùn)用越來越廣泛，常被用于防治消化道疾病[4]、免疫系統(tǒng)疾病以及炎性疾病等[5]。近年來寵物用益生菌也在迅速發(fā)展，市面在售益生菌多為乳酸菌、芽孢桿菌以及酵母菌或者為他們的混合菌劑[6]。這些益生菌大都作為腸道菌群調(diào)節(jié)劑在使用并且使用效果良莠不齊，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了快速發(fā)展的寵物市場的需求。本文綜述犬用益生菌的臨床應(yīng)用和作用機(jī)理，并結(jié)合其市場發(fā)展現(xiàn)狀以及存在的問題，對犬用益生菌的未來發(fā)展提出建議。

1 益生菌對犬的作用

1.1 調(diào)節(jié)腸道菌群防治腹瀉 腹瀉與菌群失調(diào)是相互關(guān)聯(lián)的，犬腹瀉大多是由飼養(yǎng)環(huán)境以及犬糧的改變使腸道菌群失衡導(dǎo)致的。因抗生素在殺滅侵襲菌的同時也會殺滅有益菌，加重腸道菌群失衡[7]，因此，不能盲目使用。益生菌可影響腸道菌群的定殖和組成，平衡腸道菌群及恢復(fù)正常的腸道pH值，從而緩解腹瀉癥狀[8]。ViolaStrompfová的研究表明，給犬飼喂雙歧桿菌后，與對照組相比，第7天犬腸道中乳酸菌的數(shù)量顯著升高，在第14天后，腸道有害菌顯著降低[9]。劉昆用芽孢桿菌對攻毒幼犬的腹瀉影響試驗(yàn)表明：犬糧中未添加芽孢桿菌的4只犬全都出現(xiàn)了腹瀉癥狀；而添加了芽孢桿菌的4只里只有1只出現(xiàn)了腹瀉，說明了芽孢桿菌能顯著降低腹瀉率[10]。L.Rose的雙盲試驗(yàn)也證明了在犬糧中添加益生菌可以顯著降低犬的腹瀉率[11]。吳德華將納豆芽孢桿菌添加到犬糧中以探究其對犬腸道菌群的影響，結(jié)果顯示：在仔犬犬糧中添加納豆芽孢桿菌不僅明顯降低仔犬腸道中大腸桿菌的數(shù)量，而且可增加乳酸菌的數(shù)量[12]。陳如愿的研究也表明：在灌服益生菌21 d后，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，大腸桿菌數(shù)顯著減少，而有益的乳酸菌含量大幅度增加[8]。燕珍壽探究益生菌對仔犬生長性能的影響試驗(yàn)表明：飼喂益生菌組的犬糞便中的大腸桿菌數(shù)由15.23Lg CFU/g減少為7.56 Lg CFU/g，與對照組差異顯著；飼喂益生菌組的腹瀉率僅有1.5%，而對照組腹瀉率高達(dá)32.3%，充分證明了益生菌的添加可以調(diào)節(jié)腸道菌群，預(yù)防仔犬腹瀉[13]。Gómez-Gallego的雙盲實(shí)驗(yàn)顯示在犬糧中添加益生菌可使犬在腹瀉期間的糞便稠度正?；p少犬腸道中病原菌的數(shù)量，加速腹瀉恢復(fù)[14]。

1.2 增強(qiáng)機(jī)體免疫力 益生菌在腸道中的定殖、黏附以及拮抗病原菌過程中促進(jìn)了IgA的分泌，激活了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。杜莉在犬的日糧里添加益生菌后對其血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：添加了納豆芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比總蛋白含量降低了36.03%，球蛋白含量增加了7.9%，白蛋白含量降低了16.68%，白球比降低了24.44%。說明實(shí)驗(yàn)犬免疫機(jī)能得以提高[15]。孫寧用ELISA法探究乳酸菌對犬瘟熱病毒(CDV)和細(xì)小病毒(CPV)抗體效價的影響試驗(yàn)表明：實(shí)驗(yàn)菌的添加可以有效增強(qiáng)幼犬血清中CDV、CPV的抗體水平，并能延緩抗體水平的降低[16]。

1.3 提高幼犬生長性能 仔犬在斷奶前后免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，而母源抗體的逐漸減弱、飼養(yǎng)環(huán)境等的改變最易造成其腸道功能紊亂而影響仔犬的生長發(fā)育。益生菌的使用可以調(diào)節(jié)紊亂，促進(jìn)腸道蠕動，杜絕因環(huán)境改變導(dǎo)致的應(yīng)激帶來的危害，促進(jìn)生長。陳如愿關(guān)于復(fù)合益生菌對仔犬生長性能的研究表明：在日糧里添加復(fù)合益生菌，低、中和高濃度三個實(shí)驗(yàn)組的仔犬日增重比對照分別提高了12.55%、20.71%、15.97%，說明適量的復(fù)合益生菌能顯著促進(jìn)仔犬的生長[8]。吳德華關(guān)于納豆芽孢桿菌對仔犬生長性能的影響試驗(yàn)表明：在日糧里添加1%和2%的納豆芽孢桿菌，仔犬日增重分別提高了7.51%和27.48%[12]?；糗婈P(guān)于微生態(tài)制劑對仔犬的生長性能的研究也證明了這一觀點(diǎn)：添加了益生菌的實(shí)驗(yàn)組比對照組平均日增重提高了18.76%[17]。孫寧還發(fā)現(xiàn)益生菌的添加對斷奶前仔犬的促生長效果作用不大，但在斷奶后(30日齡左右)的作用效果極明顯[18]。

1.4 緩解炎癥反應(yīng) 炎癥是由于細(xì)菌等有害物質(zhì)侵入機(jī)體后，使機(jī)體的細(xì)胞和組織發(fā)生變性、壞死等一系列病理變化。研究表明Treg細(xì)胞數(shù)目的異?？赡苁菍?dǎo)致異位性皮炎的原因，F(xiàn)oxP3分子的表達(dá)與Treg細(xì)胞密切相關(guān)且調(diào)控著Treg細(xì)胞的發(fā)育以及免疫負(fù)向調(diào)節(jié)等功能。劉欣通過流式細(xì)胞術(shù)檢測異位性皮炎的犬外周血淋巴細(xì)胞FoxP3分子的表達(dá)，檢測血清中Treg細(xì)胞的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益生菌參與治療后犬外周血淋巴細(xì)胞的FoxP3表達(dá)量明顯高于治療前和對照組。Treg細(xì)胞通過其分泌的IL-10發(fā)揮抗炎作用，且IL-10能降低組織中的IgE濃度，說明益生菌有調(diào)節(jié)炎癥的作用[19]。

1.5 預(yù)防草酸鈣結(jié)石 草酸鈣結(jié)石是犬最常見的腎結(jié)石類型，治療以手術(shù)清除為主，但近年來有報道稱益生菌可以預(yù)防草酸鈣結(jié)石的發(fā)生。Weese對犬貓腸道中乳酸菌降解草酸鹽的能力進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以在體外降解草酸鹽，因此，調(diào)節(jié)腸道乳酸菌的含量可以減少腸道草酸鹽的沉積，并相應(yīng)減少腸道草酸鹽的吸收和腎臟排泄，從而減少草酸鈣尿石癥的發(fā)病率[20]。Murphy探究益生菌代謝的試驗(yàn)也證實(shí)了益生菌可以降解草酸鹽，但在降解能力上有很大差異(試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所用的乳桿菌具有降解草酸鹽的能力而未發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌有此功能)，且體外降解能力未必很好地轉(zhuǎn)化為體內(nèi)影響(篩選出的4株具有體外降解草酸鹽能力的乳桿菌只有2株具有體內(nèi)降解草酸鹽的能力)[21]。任志華探究犬糞中乳酸菌的生物降解能力試驗(yàn)和Murphy的試驗(yàn)結(jié)果相符，不同分離株體外降解草酸的能力差異很大，其從犬糞中分離出了47株菌(22株乳桿菌，6株乳球菌，4株腸膜明串珠菌和15株腸球菌)，有24(51.06%)株具有該功能，但與空白對照組比，只有8株降解量超過5%；而15株腸球菌中具有該功能的菌株占73.33%，其中更是有5株降解能力達(dá)到32.83%，但22株乳酸菌的降解能力均不超過5%[22]。

1.6 增強(qiáng)抗氧化能力 自由基在體內(nèi)不斷積累的過程是機(jī)體氧化損傷的開始，從而加速機(jī)體的老化，縮短壽命。雖然人們對益生菌的抗氧化機(jī)理并不清楚，但已有一些試驗(yàn)證明了益生菌能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化成分和氧化還原系統(tǒng)，從而延緩機(jī)體衰老。杜莉在犬的日糧里添加益生菌后對其血液生化影響的研究表明：添加納豆芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，血漿中丙二醛(MDA)含量降低了18.19%，超氧化物岐化酶(SOD)活性增高了16.5%，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性增加了15.49%。MDA可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力[15]。陳如愿的試驗(yàn)也證明了這一觀點(diǎn)：在日糧里添加復(fù)合益生菌，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，血清中MDA含量顯著降低，T-SOD和GSH-PX活性顯著升高[8]。

2 犬用益生菌制劑的作用機(jī)理

2.1 生態(tài)平衡機(jī)理 正常情況下，機(jī)體、腸道菌群、外界環(huán)境構(gòu)成了動態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)。上述相關(guān)的因素改變都會造成該生態(tài)系統(tǒng)的功能紊亂，如環(huán)境的改變、應(yīng)激、有害菌的侵襲、抵抗力下降等都可使機(jī)體出現(xiàn)臨床癥狀。益生菌本就是腸道存在的有益菌，能產(chǎn)生大量的乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸和酶類物質(zhì)，降低腸道局部的pH，抑制炎性因子的產(chǎn)生，修復(fù)損壞的腸黏膜，從而抑制腐敗菌和致病菌的生長繁殖，以此來調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，使微生態(tài)系統(tǒng)重新恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，達(dá)到防治疾病的效果。乳酸菌在發(fā)酵的過程中，會產(chǎn)生大量乳酸和乙酸形成腸道的酸性環(huán)境，從而抑制沙門菌、李斯特菌等有害菌的生長，某些乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素還能拮抗大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌[23]。短鏈脂肪酸不僅可以調(diào)節(jié)血壓[24]、腸道免疫[25]、炎性因子[26]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[27]，還與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如2型糖尿病[28]、過敏性疾病[29]、代謝綜合征[30]等。消化酶、水解酶能促進(jìn)飼料中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的降解以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而提高飼料轉(zhuǎn)化率[31]。

2.2 生物奪氧學(xué)說 根據(jù)微生態(tài)菌群的自然定殖規(guī)律，動物出生前，在母體內(nèi)是無菌的，出生后才開始慢慢被細(xì)菌定殖。光岡知足采用嚴(yán)格厭氧技術(shù)分析了動物腸道菌群的組成，發(fā)現(xiàn)厭氧菌占多數(shù)，高達(dá)99%。雖然厭氧菌是腸道內(nèi)的第一大菌群，但其在腸道內(nèi)的定殖順序卻不是第一，腸道菌的定殖首先是需氧菌，其次是兼性厭氧菌，最后才是厭氧菌。多數(shù)病原微生物屬于需氧菌或兼性厭氧菌，當(dāng)菌群失調(diào)局部氧濃度過高時便會促進(jìn)病原菌生長[32]。當(dāng)給新生動物灌服益生菌，其能很快在腸道內(nèi)定殖，大量消耗腸道內(nèi)的氧氣，使腸道內(nèi)氧濃度降低，以便達(dá)到適于厭氧菌生長的環(huán)境，促進(jìn)厭氧菌的生長，最終達(dá)到微生態(tài)平衡。

2.3 屏障理論 腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化學(xué)屏障等構(gòu)成，腸黏膜作為機(jī)體的一道防御屏障，可抵抗病原微生物的入侵。有研究發(fā)現(xiàn)腸黏膜屏障功能失調(diào)與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)械屏障、調(diào)節(jié)腸黏膜免疫功能，從而在生物、機(jī)械、免疫三個層次增強(qiáng)腸黏膜屏障[33]。益生菌進(jìn)入腸道后可與腸道內(nèi)的致病菌競爭腸道上皮細(xì)胞上的黏附位點(diǎn)、營養(yǎng)和生存空間來達(dá)到其屏障作用，益生菌與腸黏膜緊密結(jié)合構(gòu)成腸道的生物屏障，可維持腸道微生態(tài)平衡，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，還可刺激腸道黏膜，增加黏膜細(xì)胞(如杯狀細(xì)胞)的數(shù)量，提高腸內(nèi)淋巴細(xì)胞的活性，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分泌IgA，抑制炎性因子的表達(dá)，提高T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的特異型和非特異性免疫應(yīng)答[34]。汪夢霞給幼鼠灌胃益生菌，發(fā)現(xiàn)其可以增加幼鼠結(jié)腸上皮緊密連接蛋白Claudin-1的表達(dá)量[35]。

3 犬用微生態(tài)制劑存在的問題

3.1 安全性 益生菌對機(jī)體是否無害，是應(yīng)用的首要條件。大量研究表明，市售益生菌對健康動物是安全的，但對于患病動物來講，其是否安全報道較少，所以并不能完全排除某些菌種會對機(jī)體產(chǎn)生潛在威脅的可能，有研究表明，糞腸球菌會增加空腸彎曲菌對腸道的黏附[36]。其次，微生態(tài)制劑不能產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物，如某些蠟樣芽孢桿菌可以產(chǎn)生腸毒素。益生菌是否攜帶耐藥質(zhì)?；蚩剐曰虻葐栴}也需探討。

3.2 有效性 判定益生菌是否有效的基本指標(biāo)之一是其在腸道內(nèi)的定殖能力，由于犬腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)時間很短，大約在2～3 h左右，禁食狀態(tài)下，胃排空時間僅在1 h左右[37]，如果不能在腸內(nèi)定殖，很快被排除體外，對機(jī)體產(chǎn)生的有益作用有限。另一個指標(biāo)是其效果的穩(wěn)定性，市售益生菌的活菌數(shù)都能達(dá)到國家安全規(guī)定，但由于儲存運(yùn)輸?shù)姆绞讲划?dāng)，會造成制劑活菌數(shù)量下降，達(dá)不到對機(jī)體有益的量。英國雷丁大學(xué)食品微生物學(xué)教授格倫·吉布森[38]說:“研究表明，你能在英國買到的半數(shù)(益生菌)產(chǎn)品(與其商品標(biāo)簽上的說明)不相符。它們或者含有錯誤的細(xì)菌，或者(含有細(xì)菌的)數(shù)量不足?！?/p>

3.3 質(zhì)量可控性 由于益生菌從生產(chǎn)加工到進(jìn)入宿主腸道，需經(jīng)過一系列操作，如高溫、高壓、強(qiáng)酸、高膽鹽等。如果菌種不具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，大部分將在生產(chǎn)加工過程中失活，使其產(chǎn)品質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，給生產(chǎn)帶來極大的影響。益生效果特別好的乳酸菌，其不耐高溫高壓，而犬糧在生產(chǎn)中必須經(jīng)過高溫高壓制粒，以便脫去殘存水分使其成型，就不適于作為犬糧添加劑。Biourge等曾對市售犬用益生菌的活菌數(shù)進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明，菌體在生產(chǎn)加工以及儲存運(yùn)輸過程中極易失活[39]。

4 展 望

益生菌作為一種無毒、無殘留、無副作用的添加劑已被許多行業(yè)認(rèn)可并應(yīng)用。在人醫(yī)上益生菌已被用于治療炎癥性腸病、易激綜合征、腸道腫瘤、乳糖不耐癥[40]、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎[41]及新生兒黃疸[42]、肝硬化[43]等多種疾病。陳炯發(fā)現(xiàn)益生菌對嬰兒濕疹有良好的療效[44]；Isolauri發(fā)現(xiàn)益生菌可以盡快控制過敏反應(yīng)[45]；張兆男發(fā)現(xiàn)益生菌干預(yù)可以改善小鼠肥胖和小鼠的脂代謝紊亂[46]；Chen發(fā)現(xiàn)益生菌具有預(yù)防和抗腫瘤效應(yīng)[47]。有些學(xué)者根據(jù)這些在人醫(yī)上的文獻(xiàn)報道，推測益生菌可能在治療犬過敏、炎癥、結(jié)石甚至是肥胖和腫瘤方面也有作用，但都尚處于實(shí)驗(yàn)階段，未應(yīng)用于伴侶動物臨床中。截止到目前，益生菌在伴侶動物中的應(yīng)用還主要集中在飼料添加劑以及一些功能性保健品上，尚無作為治療疾病的專用藥而被寵物醫(yī)師們所使用。

雖然犬用益生菌發(fā)展前景廣闊，但在臨床診療上的應(yīng)用還處于起步階段，并且現(xiàn)階段犬用益生菌產(chǎn)品尚未制定相關(guān)的制造及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，造成其產(chǎn)品質(zhì)量安全性低、有效性弱、質(zhì)量可控性差。綜合以上問題，筆者為以后的犬用益生菌的發(fā)展提出以下建議：①利用材料化工及其相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)，提高益生菌對環(huán)境的耐受能力，確保其活菌數(shù)，增加其有效性；②篩選優(yōu)良基因工程菌，以獲得更安全、易定植、繁殖力強(qiáng)的菌株；③研制出針對某些疾病的專用益生菌制劑，使其作用更專一、高效；④加快制定相關(guān)的國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范市場以確保產(chǎn)品質(zhì)量。