動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉業(yè)兵，曹利利，郭衍冰，才學(xué)鵬*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，長春 130062 )

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，可感染所有溫血?jiǎng)游颷1-2]。感染宿主后隨著血液到達(dá)全身各個(gè)部位，對(duì)人及動(dòng)物造成極大的威脅。人感染率一般為10%～60%[3]，最高可達(dá)95%[4]，我國人群弓形蟲平均感染率約為10%[5]，孕婦感染弓形蟲后約有20%的機(jī)率從母體垂直傳播給胎兒[6]，引起胎兒先天性感染，造成流產(chǎn)或死胎等。弓形蟲感染免疫功能減退或受損的機(jī)體可能會(huì)造成廣泛的病理損害甚至危及生命。

弓形蟲可感染豬、牛、羊等家畜，在一些伴侶動(dòng)物犬、貓、兔等弓形蟲感染情況較為普遍，在給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，也為食品安全與人類健康埋下了重大隱患[7]。弓形蟲感染動(dòng)物后常表現(xiàn)為非特異的臨床癥狀，無法根據(jù)臨床癥狀實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確診斷。因此，了解動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用情況，對(duì)切實(shí)維護(hù)養(yǎng)殖業(yè)安全、動(dòng)物源性食品安全、公共衛(wèi)生安全至關(guān)重要。

1 病原學(xué)檢測(cè)

病原學(xué)檢查常用的方法包括鏡檢法和接種法。前者主要是根據(jù)樣本(肺、肝、淋巴結(jié)或體液、腦脊液等)特性，選擇涂片、固定或染色等方式通過顯微鏡觀察結(jié)果[8]；后者是將樣本經(jīng)處理后通過接種至動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞(如Hela、Vero)等進(jìn)行培養(yǎng)，而后檢測(cè)弓形蟲的方法[9]，這兩種方法雖然不適合大批量樣本的快速檢測(cè)，但操作較為簡單，結(jié)果直觀可靠，在動(dòng)物弓形蟲的診斷及預(yù)防中發(fā)揮了重要作用。Khademvatan S等以顯微鏡直接涂片檢查了伊朗230只嚙齒動(dòng)物的弓形蟲寄生情況，結(jié)果顯示有1例感染[10]。Atasever A等使用血清為弓形蟲陽性的鵪鶉組織接種小鼠，并順利從感染小鼠的腹膜液中分離并鑒定出弓形蟲[11]。在弓形蟲病的檢測(cè)實(shí)踐過程中，傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法因費(fèi)時(shí)、費(fèi)力以及檢出率低等原因，已無法滿足高效、快速檢測(cè)人和動(dòng)物弓形蟲感染的需求。

2 血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)方法是上個(gè)世紀(jì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)弓形蟲的首選和最常用的方法。該方法主要使用弓形蟲特異性抗原，通過測(cè)定宿主感染后體內(nèi)相應(yīng)抗體(IgA、IgM、IgG和IgE)進(jìn)行判定。大多數(shù)血清學(xué)方法使用弓形蟲裂解物抗原(TLA)、小鼠或組織培養(yǎng)物中的速殖子抗原作為天然抗原。但是，制備這些抗原所需的實(shí)驗(yàn)室條件及技術(shù)要求各不相同，且制備費(fèi)時(shí)、成本較高以及存在感染風(fēng)險(xiǎn)等問題不容忽視[12]。

2.1 薩賓-費(fèi)爾德曼染色試驗(yàn)(Sabin-Feldman dye test, SFDT) Sabin和Fedman 1948年首次提出SFDT，利用活的弓形蟲滋養(yǎng)體能被堿性美藍(lán)染成藍(lán)色的特性，以加入致活劑和免疫血清(抗體)后不著色或著色很淡為判斷陽性的依據(jù)，可用于早期檢測(cè)，被認(rèn)為是弓形蟲感染血清學(xué)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，很多學(xué)者運(yùn)用SFDT法對(duì)不同動(dòng)物進(jìn)行過弓形蟲檢測(cè)。Chadwick EA 等通過該方法檢測(cè)英國水獺中弓形蟲的感染率為39.5%，表明淡水生態(tài)系統(tǒng)因糞便含有卵囊而導(dǎo)致較高的流行率[13]。Beyhan YE等以SFDT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，弓形蟲在研究區(qū)域的水牛中相當(dāng)常見，感染率高達(dá)87.79%[14]。SFDT與其他方法相比具有較高的符合率，作為一種最早被使用和公認(rèn)的敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的血清免疫學(xué)方法，因其需要以活蟲為抗原和含有輔助因子的血清作為致活劑，不僅增加了試驗(yàn)的危險(xiǎn)性，還加大了檢測(cè)成本及操作難度，極大限制了該方法的推廣應(yīng)用。

2.2 凝集試驗(yàn)

2.2.1 改良凝集試驗(yàn)(Modified agglutination test , MAT) MAT是Dubey和Desmonts于1987年在直接凝集試驗(yàn)(Direct haemagglutination test，DAT)基礎(chǔ)上建立的一種特異、敏感的弓形蟲檢測(cè)方法。檢測(cè)前只需制備純凈的弓形蟲速殖子，其表面抗原能夠與被檢血清中弓形蟲特異性IgG抗體發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)染色后可依據(jù)反應(yīng)孔底部的抗原積層進(jìn)行判斷。MAT的特異性和敏感性與DAT相似，有報(bào)道稱MAT在對(duì)犬血清檢測(cè)過程中會(huì)出現(xiàn)較高的假陰性[15]，但該方法對(duì)其他寄生蟲無特異性反應(yīng)，且操作程序及所需試驗(yàn)工具相對(duì)簡單，判定標(biāo)準(zhǔn)明確，對(duì)于樣本的初篩具有重要的意義。Feg V等以MAT法檢測(cè)散養(yǎng)雞群弓形蟲感染情況，結(jié)果顯示感染率為16.6%[16]。Almería S等利用MAT法調(diào)查發(fā)現(xiàn)，綿羊的弓形蟲感染率為41.2%，牛為18.6%，山羊?yàn)?.6%；在野生蹄類動(dòng)物中，紅鹿的弓形蟲感染率為10.5%，黇鹿為15.6%，摩弗倫羊?yàn)?.6%，西班牙山羊?yàn)?.6%，獐鹿為13.6%，野豬為18.6%[17]。Heddergott M等用MAT在歐洲中部檢測(cè)浣熊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有37.4%的感染弓形蟲[18]。至今，MAT方法因其良好的特異性及敏感性一直被各國廣泛應(yīng)用于動(dòng)物弓形蟲的調(diào)查或研究工作中。

2.2.2 間接血凝試驗(yàn)(Indirect hemagglutination test, IHA) IHA是利用弓形蟲可溶性抗原致敏于紅細(xì)胞表面，當(dāng)與相應(yīng)抗體相互反應(yīng)時(shí)即可出現(xiàn)肉眼可見的凝集。因IHA方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，故而適于大規(guī)模的流行性調(diào)查。Zhang XX等對(duì)我國北方流浪狗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染率為14.05%[19]。Luo H等對(duì)我國江西省動(dòng)物園及家畜弓形蟲感染調(diào)查結(jié)果顯示，長頸鹿感染率為27%，狼為20%，河馬為17%，小天鵝為22%；家畜中山羊感染率為10%，水牛為17%，牛為11%[20]。同時(shí)，對(duì)湖北野生動(dòng)物的調(diào)查結(jié)果顯示，野豬感染率為7.2%，野兔為5.1%，野雞為12.6%[21]。Wu F等利用IHA 法在屠宰豬中檢測(cè)弓形蟲感染率為19.9%[22]。但是，致敏紅細(xì)胞的不穩(wěn)定性使該方法易產(chǎn)生非特異性凝集，與其他診斷方法相比重復(fù)性較差[23]。

2.2.3 乳膠凝集試驗(yàn)(Latex agglutination test, LAT) LAT是以乳膠顆粒包被弓形蟲可溶性抗原，加入待檢血清后，通過觀察凝集反應(yīng)進(jìn)行結(jié)果判定，若結(jié)果為陽性則需要再以其他血清學(xué)方法開展進(jìn)一步檢查。Patel KK等以市售LAT和ELISA試劑檢測(cè)新西蘭的養(yǎng)殖紅鹿，以此評(píng)估兩者敏感性和特異性分別為84.4%和91.1%[24]。Oi M等利用商品化LAT調(diào)查了日本東京1999-2001年和2009-2011年間被收容的貓、狗的弓形蟲感染血清陽性率，結(jié)果顯示十年中感染率幾乎無變化(貓由5.6%變?yōu)?.7%，狗由1.8%變?yōu)?.9%)[25]?？梢哉f，LAT具有操作簡便、結(jié)果易判及特異性良好等特點(diǎn)，能夠快速方便的檢測(cè)到抗弓形蟲IgG抗體，適合于動(dòng)物弓形蟲的早期感染和抗體檢測(cè)，常作為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大范圍流行病學(xué)篩查的手段。

2.3 間接熒光抗體試驗(yàn)(Indirect fluorescence antibody test, IFAT) 間接熒光抗體試驗(yàn)以固定的弓形蟲速殖子制作抗原片，通過熒光素標(biāo)記的二抗檢測(cè)特異性抗體，具有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物弓形蟲血清IgG或IgM抗體的檢測(cè)，是目前檢測(cè)早期感染較為理想的血清學(xué)試驗(yàn)方法之一[26]。Gos ML等通過該方法以弓形蟲(RH株)和犬新孢子蟲(NC1株)速殖子作為抗原，使用兔抗山羊IgG-FITC的二抗來檢測(cè)阿根廷兩個(gè)省山羊的弓形蟲和犬新孢子蟲的感染情況，結(jié)果顯示流行率分別為40.8%和5.5%[27]。Machacova T等使用IFAT發(fā)現(xiàn)意大利北部的兔子弓形蟲和犬新孢子蟲感染率分別為14.6%和1.2%[28]。Bártová E等對(duì)尼日利亞三個(gè)州的120匹馬和24頭驢進(jìn)行弓形蟲和新孢子蟲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，馬的感染率分別為24%和8%；驢中僅檢測(cè)到弓形蟲，血清陽性率為17%[29]。目前，該技術(shù)在國外廣泛被應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查，且已有敏感、穩(wěn)定的市售試劑盒，相比之下，國內(nèi)關(guān)于IFAT檢測(cè)動(dòng)物感染弓形蟲的報(bào)道較少，可能因其需要專業(yè)熒光顯微鏡觀察而限制了該方法的推廣使用。

2.4 免疫層析技術(shù)(Gold immunochromatographic assay ,GICA) GICA主要由標(biāo)記技術(shù)和層析技術(shù)組成，利用抗原與抗體反應(yīng)原理，以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，通過固相膜為載體而設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法。作為一種簡單、便捷的血清學(xué)檢測(cè)方法，適于養(yǎng)殖場(chǎng)及野外現(xiàn)場(chǎng)動(dòng)物弓形蟲的檢測(cè)。王艷等將利用弓形蟲重組抗原SAG1組裝成膠體金免疫層析試紙條篩選犬弓形蟲病，與ELISA試劑盒進(jìn)行對(duì)比符合率較高[30]。孫雪霏利用弓形蟲重組蛋白GRA7制備膠體金試檢測(cè)紙條，檢測(cè)176份豬血清的結(jié)果與Gold-ELISA方法比較具有較高的一致性[31]。目前，免疫層析技術(shù)因具有快速、操作簡便、結(jié)果易判和不需特定儀器等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用。但是當(dāng)前市場(chǎng)中試紙條的產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，存在特異性不高、假陽/陰性等現(xiàn)象。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay ,ELISA) ELISA方法利用酶的高效催化作用及底物放大反應(yīng)效果，使檢測(cè)靈敏度大大提高，提高了特異性抗原和抗體在免疫反應(yīng)過程中的敏感性，既可用于檢測(cè)抗原也可以檢測(cè)抗體。目前，國內(nèi)外已研制出很多反應(yīng)靈敏、特異性高、重復(fù)性好的動(dòng)物弓形蟲ELISA檢測(cè)試劑盒，主要檢測(cè)循環(huán)抗原(CAg)和特異性抗體(IgM和IgG)，適于大批量血清樣品的檢測(cè)，是血清學(xué)方法中一種方便且安全的方法。常用的包括間接ELISA、斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA)、親和素-生物素復(fù)合ELISA(ABC-ELISA)及雙抗夾心ELISA(DS-ELISA)等。如Zhuo X等以弓形蟲rMAG1為包被抗原建立的間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)93份狗血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其特異性和敏感性均高于以TLA為包被抗原建立的間接ELISA方法[32]。宮楓舉等建立了檢測(cè)弓形蟲循環(huán)抗原的夾心ABC-ELISA方法，檢測(cè)68份豬臨床血樣與Nest-PCR結(jié)果一致，表明該方法特異性強(qiáng)、敏感性高，可用于弓形蟲急性感染的早期或活動(dòng)期的診斷[33]。寇金華用制備的抗弓形蟲重組蛋白SAG3單克隆抗體建立豬弓形蟲雙抗夾心ELISA法，并對(duì)廣東、吉林地區(qū)各94份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽性率分別為20.2%和11.7%，與建立的膠體金試紙條做對(duì)比，兩者符合率分別為90.90%和89.47%[34]。ELISA及其衍生的一系列血清學(xué)方法具有可重復(fù)、易自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，還能用于定性和定量檢測(cè)，是目前應(yīng)用最廣的動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)方法。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR) PCR技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增弓形蟲基因組的特定片段，產(chǎn)生數(shù)百萬個(gè)拷貝的靶DNA分子，與其他衍生出的檢測(cè)方法，如巢氏PCR、多重PCR和PCR-RFLP等方法一樣，都能通過多次擴(kuò)增基因片段而提升檢測(cè)的敏感性和特異性。常用的引物靶基因有B1基因、529 bp重復(fù)序列、18S rDNA、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和SAG1 (P30)基因等，這些基因在所有弓形蟲株中均為高度保守。Liu XC等基于弓形蟲ITS-1基因構(gòu)建PCR法，對(duì)雞場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示2%的散養(yǎng)雞場(chǎng)為弓形蟲陽性，而規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)未發(fā)現(xiàn)弓形蟲[35]。Nabi H等的研究表明，與顯微鏡法相比，PCR是檢測(cè)貓弓形蟲糞便卵囊的更可靠方法[36]。Cong W等以半巢式PCR檢測(cè)弓形蟲B1基因和PCR-RFLP方法對(duì)我國山東省618份驢肌肉樣本進(jìn)行檢測(cè)，并首次從驢體內(nèi)分離出弓形蟲ToxoDB#1基因型[37]。Lukasova R等對(duì)2014-2015年期間來自南非110份野生鳥和15份家養(yǎng)鳥的腦組織樣本進(jìn)行調(diào)查，通過PCR方法確定2.7%的野生鳥存在弓形蟲感染，且采用多重PCR對(duì)陽性樣品進(jìn)行基因分型分析，結(jié)果確定紅眼鴿感染的弓形蟲為II型[38]。隨著技術(shù)體系的不斷完善和發(fā)展，PCR及相關(guān)衍生技術(shù)因快速、靈敏、簡便和可靠等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。

3.2 實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR) qPCR是將探針技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合，每個(gè)循環(huán)中通過探針和嵌合染料檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，利用標(biāo)準(zhǔn)已知濃度進(jìn)行定量，又稱熒光定量PCR。該方法具有較高的特異性和敏感性，可用于評(píng)估動(dòng)物弓形蟲的感染強(qiáng)度及治療效果。Sroka J等檢測(cè)60份羊奶樣品，陽性率為65%，而巢式PCR僅為43%[39]。Camilo LM等利用B1和REP-529引物對(duì)807個(gè)巴西患者臨床樣品進(jìn)行RT-PCR測(cè)定，結(jié)果顯示REP-529引物組優(yōu)于B1組[40]。由于qPCR是一個(gè)單管封閉系統(tǒng)，相比常規(guī)PCR和巢式PCR等具有靈敏度高和假陽性較少等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) LAMP是在Bst DNA聚合酶參與下用4對(duì)引物識(shí)別弓形蟲靶基因的6個(gè)區(qū)域，在等溫條件下使靶基因高效擴(kuò)增，產(chǎn)物可通過熒光定量、電泳檢測(cè)，也可通過濁度計(jì)或者離心后肉眼觀察沉淀的方法。Lass A等通過RT-PCR和靶向B1基因的LAMP方法分析弓形蟲病的起源可能追溯到空氣[41]。Lalle M等以529 bp重復(fù)序列為靶向的LAMP檢測(cè)到每50 g即食生菜中弓形蟲卵囊為25個(gè)[42]。由于LAMP檢測(cè)時(shí)僅需水浴或普通加熱裝置，能直接觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物，在沒有精密儀器條件下是一種快捷、簡便、敏感的診斷方法，其靈敏度和擴(kuò)增效率遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR。

4 問題與展望

弓形蟲是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲，迄今尚無理想的治療藥物，因而精準(zhǔn)的檢測(cè)對(duì)于動(dòng)物弓形蟲的有效防控至關(guān)重要。病原學(xué)檢測(cè)方法直觀且準(zhǔn)確性較高，但大規(guī)模檢測(cè)存在工作量和誤差較大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無法滿足檢測(cè)需求。靈敏度高、特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)方法為我們提供了一種較為準(zhǔn)確且標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)手段，但檢測(cè)過程繁瑣，需特殊儀器設(shè)備及人員素質(zhì)要求高，大大降低了在基層的推廣使用。血清學(xué)檢測(cè)方法尤其是ELISA方法是目前臨床應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法，然而，縱觀國內(nèi)外動(dòng)物弓形蟲血清學(xué)檢測(cè)方法的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀，大多數(shù)試劑盒都使用TLA，目的是欲獲得較高敏感性和特異性的檢測(cè)結(jié)果，這些方法卻存在普遍的局限性，如無法估計(jì)弓形蟲感染的準(zhǔn)確階段，試驗(yàn)難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范和受其他寄生蟲干擾等。因此，動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)仍存在諸多問題亟待解決。

然而，相較于以往，動(dòng)物弓形蟲的檢測(cè)技術(shù)已有較大進(jìn)展，國內(nèi)外弓形蟲檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品的研究也越來越多，很多研究成果已經(jīng)或正在從實(shí)驗(yàn)室向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。如今，基因工程技術(shù)發(fā)展日趨成熟，弓形蟲抗原相關(guān)研究有了很多新進(jìn)展，隨著弓形蟲重組抗原、嵌合抗原和多表位肽抗原研究不斷深入，人們逐步以重組抗原代替TLA進(jìn)行動(dòng)物弓形蟲的血清學(xué)檢測(cè)，打破傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性已不再是空談。相信隨著科技的不斷進(jìn)步，動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)方法將會(huì)朝著簡便、快速、精準(zhǔn)、經(jīng)濟(jì)以及滿足多種檢測(cè)需求的發(fā)展方向繼續(xù)前行。