犬細(xì)小病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

孫明潔，董國(guó)英，張雪竹，胡桂學(xué)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118; 2.北京師范大學(xué) 全球變化與地球系統(tǒng)科學(xué)研究院，北京100875)

犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus, CPV)是一種引起犬科和多種野生食肉動(dòng)物的接觸性傳染病的病原體，以胃腸炎和心肌炎為主要臨床癥狀。其中2～4月齡的幼犬感染風(fēng)險(xiǎn)最大，發(fā)病率和致死率均可達(dá)到70%左右。CPV為細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，基因組全長(zhǎng)5.3 kb，是自主復(fù)制的線性單鏈負(fù)股DNA病毒，基因遺傳進(jìn)化關(guān)系顯示CPV與貓細(xì)小病毒(FPLV)、水貂腸炎病毒(MEV)和藍(lán)狐細(xì)小病毒(BFPV)親緣關(guān)系較近[1]。CPV有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)1和2，其中ORF1編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，ORF2由VP1和VP2組成。VP2蛋白是病毒衣殼的主要成分，在抗原性與宿主范圍等方面起著重大作用[2]。1978年CPV被首次發(fā)現(xiàn)，至今近40年的時(shí)間，基因和抗原不斷發(fā)生變異，相繼出現(xiàn)了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c等變異毒株[3]。CPV VP2極易發(fā)生變異，CPV-2抗原性變體(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)相比CPV-2在VP2蛋白上有4至5個(gè)氨基酸殘基差異。這種新變異毒株在抗原性和基因序列上發(fā)生明顯變化，從而使CPV的檢測(cè)方法發(fā)生了改變。因此對(duì)CPV的實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床診斷的新型檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，以期為CPV診斷提供有效的檢測(cè)技術(shù)。

1 分子生物學(xué)檢測(cè)

1.1 傳統(tǒng)PCR技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為第一代PCR技術(shù)一直延續(xù)至今，已成為核酸診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”被廣泛應(yīng)用到病原體檢測(cè)等方面[4]。PCR檢測(cè)技術(shù)以靈敏、特異和易操作等特點(diǎn)，作為CPV檢測(cè)的主要手段被實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。劉雪燕等將PCR擴(kuò)增技術(shù)和細(xì)胞定位技術(shù)相結(jié)合建立了一種F81細(xì)胞CPV原位PCR檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法與常規(guī)免疫組化方法進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示原位PCR陽(yáng)性率較高且更精準(zhǔn)的表明病毒感染細(xì)胞的位置及程度。然而，原位PCR方法并不能大范圍的推廣，為了實(shí)現(xiàn)商品化應(yīng)用，劉忠華等學(xué)者在2002年，設(shè)計(jì)一對(duì)CPV特異引物并開(kāi)發(fā)了CPV PCR診斷試劑盒，最低可檢測(cè)10 ng CPV DNA，并實(shí)現(xiàn)商品化應(yīng)用。隨著自然選擇與疫苗免疫的驅(qū)動(dòng)，CPV基因不斷的變異導(dǎo)致當(dāng)前全世界普遍流行著4種(CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)抗原類型毒株。因此傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法已不能滿足對(duì)這4種抗原類型的精準(zhǔn)鑒定，因此有學(xué)者陸續(xù)建立多種PCR優(yōu)化改進(jìn)方法。Meggiolaro建立了一種MT-PCR方法檢測(cè)糞便中的CPV-2毒株，該方法高度敏感可檢測(cè)較低病毒水平的核酸，但是通過(guò)拷貝數(shù)或Ct值區(qū)別CPV-2疫苗株或野生毒株較難實(shí)現(xiàn)[5]。為此，有學(xué)者為了實(shí)現(xiàn)多種病原的快速檢測(cè)，開(kāi)發(fā)了一種MT-PCR檢測(cè)方法，該方法可檢測(cè)CPV、貓冠狀病毒、犬瘟熱、犬冠狀病毒、沙門氏菌、賈第蟲等12種病原體，在2014年被應(yīng)用到悉尼大學(xué)獸醫(yī)病理診斷部對(duì)小型動(dòng)物病原體進(jìn)行檢測(cè)[6]。有研究也建立了一種三重PCR/RT-PCR同時(shí)檢測(cè)CDV、CPV和CaKoV，不僅具有較高的特異性和敏感性且可同時(shí)對(duì)易感染犬的主要病毒進(jìn)行鑒定，這種方法避免了材料的浪費(fèi)，降低了污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果[7]。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)CPV臨床現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求，有學(xué)者建立了一種iiPCR檢測(cè)方法可滿足快速準(zhǔn)確的PON檢測(cè)，并且iiPCR 檢測(cè)方法的敏感性可與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)Real-Time PCR相同，90 min即可獲得檢測(cè)結(jié)果，可滿足研究者臨床檢測(cè)的需求[8]。雖然不斷的對(duì)傳統(tǒng)CPV PCR檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，但是仍不能滿足當(dāng)前的臨床需求。

1.2 熒光定量PCR(Real-Time PCR，qPCR) qPCR是1996年由美國(guó)ABI公司首先開(kāi)發(fā)的第二代PCR技術(shù)，分為染料法(SYBR Green)和探針?lè)?TaqMan)。qPCR不僅特異性、敏感性和重復(fù)性都優(yōu)于傳統(tǒng)的PCR，而且探針?lè)稍O(shè)計(jì)多種探針實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，可滿足CPV多種亞型的一次鑒別，省時(shí)省力被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。有研究建立了一種CPV多重qPCR檢測(cè)方法，該方法可對(duì)當(dāng)前多種CPV亞型毒株進(jìn)行鑒別診斷，為精準(zhǔn)治療提供最有效的檢測(cè)結(jié)果[9]。曹雪峰等也建立了一種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，即CPV新型原液qPCR檢測(cè)方法，此方法可省略核酸提取步驟進(jìn)行快速qPCR反應(yīng)，且特異性好，重復(fù)性穩(wěn)定，離散程度小，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均不超過(guò)1.3%，該方法與核酸qPCR均最低可檢測(cè)10 copies/μL, 但是新型原液qPCR方法不僅節(jié)約檢測(cè)成本且效率更高[10]。然而，qPCR方法需要昂貴的儀器設(shè)備，很難開(kāi)展大范圍的臨床應(yīng)用，只可滿足實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)及分析。

1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) LAMP是由日本學(xué)者在2000年開(kāi)發(fā)的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，其通過(guò)在靶DNA鏈6個(gè)不同區(qū)段設(shè)計(jì)4條特異引物在鏈置換DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。該方法特異性高，操作簡(jiǎn)單只需恒溫水浴鍋即可在1 h內(nèi)完成，且只需根據(jù)擴(kuò)增物的有無(wú)即可完成診斷。2010年郭偉開(kāi)發(fā)了CPV LAMP檢測(cè)方法，并在不斷優(yōu)化的過(guò)程發(fā)現(xiàn)，鎂離子為8 mmol/L擴(kuò)增效率最高，特異性好，最低可檢測(cè)5.7個(gè)拷貝，相比普通PCR敏感100倍[11]。Parthiban曾在2012年建立了可快速現(xiàn)場(chǎng)診斷的CPV LAMP檢測(cè)技術(shù)，該方法相比普通PCR和巢式PCR更敏感準(zhǔn)確，被認(rèn)為是最具潛力的CPV診斷方法[12]。但是LAMP方法易因污染造成假陽(yáng)性結(jié)果，一直備受爭(zhēng)議。因此有學(xué)者在LAMP方法反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green Ⅰ，并利用國(guó)內(nèi)首臺(tái)恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀Deaou-308C實(shí)現(xiàn)全程封閉檢測(cè)，可在63 ℃ 45 min完成檢測(cè)，最低敏感度為3.72 copies/μL，并成功應(yīng)用到大熊貓CPV檢測(cè)診斷，具有極高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[13]。盡管許多高效和快捷的CPV檢測(cè)方法陸續(xù)應(yīng)用到臨床檢測(cè)試驗(yàn)中，但是仍面臨著因病毒含量較低而誤判結(jié)果。因此有研究者又對(duì)LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)，利用免疫捕獲可濃縮病毒粒子技術(shù)建立了CPV IC-LAMP檢測(cè)方法，并與ELISA和LFD試驗(yàn)相結(jié)合，檢測(cè)的敏感性均為10-1TCID50，并可省略DNA提取步驟，在90 min內(nèi)即可用肉眼直接判定檢測(cè)結(jié)果而被廣泛認(rèn)可[14]。隨著LAMP技術(shù)不斷的優(yōu)化改進(jìn)，使該檢測(cè)方法不僅成本低、操作簡(jiǎn)便、敏感性高，而且可直接應(yīng)用于臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，是當(dāng)前應(yīng)用于寵物醫(yī)院臨床診斷中最具潛力的檢測(cè)方法。

1.4 重組聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)(Recombinase Polymerase Amplification, RPA) RPA是核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的一種新型檢測(cè)方法，該方法首先通過(guò)能結(jié)合單鏈核酸的重組酶與引物形成蛋白-引物復(fù)合物并與引物的同源性雙鏈DNA靶標(biāo)序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，隨后在單鏈結(jié)合蛋白的作用下進(jìn)行DNA鏈交換反應(yīng)形成穩(wěn)定的DNA單鏈，最終啟動(dòng)鏈置換DNA聚合酶進(jìn)行指數(shù)式核酸擴(kuò)增反應(yīng)[15]。RPA在37～42 ℃恒溫條件并能在15 min即可完成結(jié)果判定，該方法省略了PCR技術(shù)中變性、退火和延伸3個(gè)變溫步驟，真正實(shí)現(xiàn)了便攜式恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)而被稱為可以替代PCR檢測(cè)的新技術(shù)[16]。RPA在Basic-RPA技術(shù)之上又延伸發(fā)展了探針?lè)≧PA和側(cè)流層析試紙條RPA，實(shí)現(xiàn)了用肉眼直觀判定檢測(cè)結(jié)果的便捷性。Liu等基于CPV VP2基因開(kāi)發(fā)了一種可視且無(wú)需設(shè)備的LFS RPA檢測(cè)方法，在拳頭內(nèi)以體熱封閉15 min后，并在5 min內(nèi)即可在LFS肉眼判定結(jié)果。該檢測(cè)方法不僅實(shí)現(xiàn)了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c等多種亞型CPV的檢測(cè)，且可最低檢測(cè)1×102拷貝每個(gè)反應(yīng)，具備了與qPCR的檢測(cè)敏感度[17]。Geng等建立了一種基于exo探針的實(shí)時(shí)RPA CPV-2檢測(cè)方法，該方法快速、簡(jiǎn)單12 min即可讀取結(jié)果且最低可檢測(cè)10 拷貝每個(gè)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了在條件限制的野外檢測(cè)，為檢疫站、港口和基層獸醫(yī)工作者提供了便攜且高效的CPV-2檢測(cè)技術(shù)[18]。RPA檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種病毒檢測(cè)，然而因其成本較高還不能大范圍推廣，但是該方法的特異性、敏感性和便攜性都較傳統(tǒng)PCR技術(shù)更優(yōu)越，因此該方法將會(huì)成為CPV檢測(cè)的新標(biāo)準(zhǔn)。

2 免疫學(xué)檢測(cè)

2.1 血凝及血凝抑制試驗(yàn) 血凝(HA)及血凝抑制(HI)試驗(yàn)是免疫學(xué)試驗(yàn)中最簡(jiǎn)單且最廉價(jià)的檢測(cè)方法，基于某類病毒或病毒的血凝素能選擇的與動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)生凝集的現(xiàn)象，而HI試驗(yàn)是利用特異性抗體與病毒結(jié)合，使其失去凝集紅細(xì)胞能力，抑制血凝發(fā)生的試驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)直觀可靠，已廣泛應(yīng)用于禽流感病毒、新城疫病毒和犬細(xì)小病毒等檢測(cè)試驗(yàn)中。CPV可凝集豬、倉(cāng)鼠、恒河猴、貓和馬等紅細(xì)胞，并與醛化的豬紅細(xì)胞凝集更顯著。通過(guò)HA和HI試驗(yàn)同時(shí)可反映病毒的血凝滴度及犬血清中抗體的血凝抑制效價(jià)，但是該方法受多種外源因素影響如血細(xì)胞種類、新鮮度等。該方法敏感性及特異性均低于分子檢測(cè)方法，因此常作為檢測(cè)的輔助手段及病毒分型鑒定方法。

2.2 ELISA ELISA法因其操作簡(jiǎn)單、靈敏便捷被認(rèn)為是當(dāng)前疾病檢測(cè)的主要方法之一。ELISA不僅可以進(jìn)行抗原檢測(cè)，還可應(yīng)用于免疫抗體的檢測(cè)及評(píng)價(jià)，是多樣品檢測(cè)的最好試驗(yàn)方法之一，廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。Elia利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的CPV VP2蛋白作為間接ELISA的包被抗原，構(gòu)建CPV的間接ELISA方法，使用該方法可用來(lái)檢測(cè)母源抗體對(duì)幼崽的干擾閾值[19]。趙國(guó)星首次利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)的CPV病毒樣顆粒作為包被抗原，建立了一種檢測(cè)CPV抗體的間接ELISA方法，該方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清1∶640稀釋仍能檢出陽(yáng)性，可適用于大量樣本檢測(cè)并作為流行病學(xué)調(diào)查的可靠方法[20]。近年來(lái)，相繼建立了CPV競(jìng)爭(zhēng)ELISA法、雙抗體夾心ELISA法、Dot-ELISA法等，這些方法都已被應(yīng)用到血清學(xué)抗體檢測(cè)及制成商品化試劑盒[21]。ELISA檢測(cè)方法因其穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、可批量樣品檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已成為免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法之一。

2.3 免疫層析技術(shù) 免疫層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用到快速檢測(cè)卡制備，已建立多種病毒的檢測(cè)卡如犬瘟熱病毒、豬流行性腹瀉病毒和犬細(xì)小病毒等。該方法應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)使抗原抗體特異性結(jié)合更直觀，更準(zhǔn)確。當(dāng)前研究制備的檢測(cè)試紙條是獸醫(yī)臨床一線和寵物醫(yī)院必備的疾病診斷工具，可快速的讀取結(jié)果，是作為診斷治療的重要輔助手段。朱軍等測(cè)試了3種商品化CPV快速檢測(cè)卡的臨床使用效果并與PCR診斷相比對(duì)，共計(jì)檢測(cè)了213份糞便樣品，3種檢測(cè)卡的敏感性在66.4%～72.2%，特異性在96%以上，符合率為95.8%～99.5%之間，表明當(dāng)前商品化快速檢測(cè)卡基本無(wú)差異，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠，雖然相比PCR方法敏感性低，但是其快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單，獲得使用者的一致認(rèn)可，也為診斷治療爭(zhēng)取了寶貴的時(shí)間[22]。Tinky等研究者利用IC試紙條與PCR方法同時(shí)進(jìn)行糞便樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示IC試紙條相對(duì)PCR敏感性為72.22%，特異性為92.86%，使用McNemar統(tǒng)計(jì)分析顯示兩種方法差異不顯著(P>0.5)，因此IC試紙條可作為臨床快速診斷的有效工具[23]。但是當(dāng)前使用的商品化試紙條價(jià)格普遍偏高，不適于大量樣本的快速診斷，因此馬輝等學(xué)者為了降低免疫層析試紙條的使用成本，制備了可穩(wěn)定產(chǎn)生CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3E2，建立了一種免疫膠體金層析試紙條，該方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，具備較高的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值[24]。隨著免疫膠體金技術(shù)的快速發(fā)展，有研究建立了雙抗體夾心法CPV膠體金試紙條(CPV-GIA)，利用該方法評(píng)價(jià)CPV疫苗免疫效果，依據(jù)可使免疫試紙條消失的最高血清稀釋倍數(shù)判斷CPV的抗體HI效價(jià)，數(shù)據(jù)顯示血清最高稀釋倍數(shù)乘以4即為HI效價(jià)，該方法與HI檢測(cè)效價(jià)符合率為90.7%，CPV-GIA可作為犬CPV抗體水平評(píng)價(jià)快捷且簡(jiǎn)單的方法[25]。目前，免疫膠體金試紙條技術(shù)成熟穩(wěn)定可直接采集肛門拭子進(jìn)行測(cè)試，并在10 min內(nèi)即可讀取結(jié)果，已成為寵物醫(yī)院CPV檢測(cè)的主要方法。

3 其他檢測(cè)方法

隨著試驗(yàn)和臨床檢測(cè)的要求越來(lái)越高，CPV檢測(cè)技術(shù)也在不斷更新進(jìn)步，當(dāng)前為了滿足多類型CPV毒株的檢測(cè)，如快速微型測(cè)序方法可實(shí)現(xiàn)毒株快速分型，可廣泛應(yīng)用于精準(zhǔn)診斷和流行病學(xué)調(diào)查[26]；PCR-RFLP應(yīng)用于CPV和MEV的檢測(cè)及鑒別[27]。同時(shí)為了評(píng)價(jià)疫苗免疫后CPV抗體水平，有學(xué)者建立了CPV IgM-IgG雙重快速測(cè)定法[28]；Thomas同時(shí)也利用截短的VP2蛋白構(gòu)建了乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)評(píng)價(jià)血清中CPV中和抗體[29]。根據(jù)當(dāng)前不同的試驗(yàn)需求，研究者不斷的將新型檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到CPV檢測(cè)中，并開(kāi)發(fā)出具有多種功能的新型檢測(cè)方法。

4 結(jié) 語(yǔ)

CPV基因突變率與RNA病毒相當(dāng)，形成CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等變異毒株，促使實(shí)驗(yàn)室和獸醫(yī)臨床檢測(cè)技術(shù)需要不斷創(chuàng)新以滿足科研與生產(chǎn)的需要。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)最敏感，最準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，但是因其需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、費(fèi)時(shí)及專業(yè)的操作人員，并不能大規(guī)模推廣應(yīng)用。免疫學(xué)技術(shù)可檢測(cè)到血清中抗體，但是不能檢測(cè)急性感染，因此免疫學(xué)檢測(cè)方法常被用來(lái)做疫苗免疫后的抗體水平分析及為犬制定免疫計(jì)劃。因此依據(jù)當(dāng)前CPV檢測(cè)需求，選擇合理的診斷方法才能獲得真實(shí)有效的檢測(cè)結(jié)果。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)多使用高敏感性和特異性的多重qPCR實(shí)現(xiàn)CPV毒株類型精準(zhǔn)鑒定。寵物醫(yī)院等臨床工作者更偏向使用免疫膠體金試紙條作為CPV快速診斷工具，并結(jié)合血常規(guī)等結(jié)果判定急性感染病例。但是有學(xué)者對(duì)CPV臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，顯示PCR和免疫試紙條對(duì)陽(yáng)性病例的診斷并沒(méi)有足夠的敏感性[30]。希望隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，建立一種快速、敏感、低成本的檢測(cè)技術(shù)，滿足CPV實(shí)驗(yàn)室和臨床檢測(cè)需求，為當(dāng)前細(xì)小病毒臨床檢測(cè)、基因變異、宿主范圍擴(kuò)展機(jī)制提供有效的試驗(yàn)方法。