四季草顆粒純化工藝改進(jìn)研究

龐秀清，李勇軍，何迅

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004；2.貴州省食品檢驗(yàn)檢測所，貴州貴陽550004）

四季草顆粒已上市銷售多年，用于治療泌尿系統(tǒng)疾病，療效顯著[1－2]。原生產(chǎn)工藝為水煮醇沉工藝，乙醇用量較大，工藝耗時(shí)較長，能耗大，有效成分損失也較為嚴(yán)重，可能會(huì)影響其療效。吸附澄清劑純化中藥提取液是近年發(fā)展起來的一種新技術(shù)[3]，具有用量少、工藝簡單、天然無毒、成本低、有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于中藥提取純化工藝研究。本研究中采用吸附澄清工藝代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝用于四季草顆粒工藝改進(jìn)，不僅克服了傳統(tǒng)工藝的弊端，同時(shí)對中藥民族藥資源的研究開發(fā)也起到了探索和示范作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

LC－10Avp型高效液相色譜儀（日本島津公司）；WML色譜工作站（廣西威瑪龍色譜科技公司）；AE240型電子天平（十萬分之一，梅特勒－托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

槲皮苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111538－200403）；四季紅Polygonum capitatum D.Don，車前草Plantago asiatica藥材購于貴陽市藥材市場，由貴陽醫(yī)學(xué)院藥物研究開發(fā)中心生藥學(xué)研究室（中藥民族藥標(biāo)本館長）龍慶德教授鑒定，符合相關(guān)規(guī)定，均為正品[1，4－6]；殼聚糖（浙江玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司）；ZTC1＋1天然澄清劑（天津振天成科技有限公司）；101果汁澄清劑（上海沃遜生物工程有限公司）；明膠（上海魯博明膠有限公司）；果膠酶（杰諾生物酶公司）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司），水為純凈水；甲睪酮片（天津飛鷹制藥有限公司，批號(hào)為0804002）；前列康(浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號(hào)為081028)；消痔靈(北京雙鶴高科天然藥物有限公司，批號(hào)為090705)。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼用，動(dòng)物合格證號(hào)為云動(dòng)管9806號(hào)。將小鼠隨機(jī)分為4組，各10只。

2 方法與結(jié)果

2.1 槲皮苷含量測定[7－11]

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸（38∶62）；流速：1 mL／min；檢測波長：360 nm；柱溫：35℃。理論板數(shù)按槲皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。在該色譜條件下，按2005年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥD中高效液相色譜法測定，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

稱取槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為50 μg／mL的溶液，搖勻，即得對照品溶液。按處方比例稱取經(jīng)粉碎成粗粉的四季紅和車前草，加水煎煮3次（12倍、8倍、8倍），濾過，合并濾液，濃縮至1∶6[藥材(g)∶藥液(mL)]，備用，即得四季草顆粒提取液；精密吸取試驗(yàn)樣品適量，用濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。

2.2 吸附澄清劑選擇[12－13]

取樣品提取液，均分為7份，1份取樣測定槲皮苷的含量，其余6份分別按比例加入101果汁澄清劑、殼聚糖、ZTC1＋1、明膠、果膠酶5種常用吸附澄清劑，攪拌，靜置過夜，抽濾，量取濾液體積，分別取樣測定槲皮苷含量和總固體物。以槲皮苷轉(zhuǎn)移率和總固體收率為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，水煎藥液槲皮苷提取率為63.15%，總固體收率為16.75%。結(jié)果見表1?？梢?，以殼聚糖為吸附澄清劑的澄清效果最好，故選擇殼聚糖作為四季草顆粒水提液的吸附澄清劑。

表15 種不同吸附澄清劑篩選試驗(yàn)結(jié)果（%，n＝3）

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 因素水平表

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，用殼聚糖處理綜合效果較好，故采用正交試驗(yàn)對其吸附除雜的影響因素進(jìn)行考察。通過預(yù)試驗(yàn)，藥液的濃縮比例（因素A）、吸附澄清劑加入量（因素B）、藥液的pH（因素C）是影響其吸附效率的主要因素[7]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表2。

2.3.2 指標(biāo)選擇

采用綜合評分法，以槲皮苷和總固體物轉(zhuǎn)移率為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，權(quán)重系數(shù)分別為0.8和0.2。綜合評分值＝(槲皮苷轉(zhuǎn)移率／最大槲皮苷轉(zhuǎn)移率)×80＋(總固體轉(zhuǎn)移率／最大總固體轉(zhuǎn)移率)×20。結(jié)果見表3。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

2.3.3 方差分析

由表4可知，三因素均有顯著性差異（P＜0.05）；在所選因素范圍內(nèi)，各因素作用主次順序?yàn)锳＞C＞B。最佳工藝條件為A3B2C2，即藥液濃縮至1∶8[生藥(g)∶藥液(mL)]，pH＝4，每升藥液加入1%殼聚糖冰醋酸溶液100 mL。靜置24 h，抽濾，收集濾液，備用。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.4 原純化工藝與新純化工藝比較

結(jié)果見表5。四季草顆粒藥材水煎煮液采用殼聚糖吸附純化，槲皮苷損失較?。徊捎靡掖汲恋硖幚?，槲皮苷損失較大；2種處理方法所得總固體物和水煎液比較均降低了約35%，達(dá)到了試驗(yàn)?zāi)康?。采用殼聚糖處理，避免了使用大量乙醇，有利于安全生產(chǎn)。

表5 原工藝與新工藝研究結(jié)果（%，n＝3）

表6 對甲睪酮引起小鼠前列腺增生的影響（n＝3）

表7 對消痔靈引起小鼠前列腺炎的影響（n＝3）

2.5 原純化工藝與新純化工藝樣品藥效學(xué)比較

取2.4項(xiàng)下所得樣品，加入蒸餾水配制成溶液。以0.35 g／kg的劑量進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)，考察四季草顆粒對甲睪酮所致小鼠前列腺增生，對消痔靈所致小鼠前列腺炎的影響[14－16]。實(shí)驗(yàn)過程中，模型組死亡1只，原工藝組死亡2只，新工藝組死亡1只。結(jié)果見表6和表7。與模型組比較，四季草顆粒新工藝組、原工藝組前列腺質(zhì)量及前列腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），但無顯著性差異（P＞0.05）。與模型組比較，四季草顆粒新工藝組、原工藝組前列腺質(zhì)量及前列腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），但無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)時(shí)，為保證吸附澄清劑在試驗(yàn)過程中能發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)，故再進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化工藝條件，以期得到最佳吸附澄清工藝。選擇處方主藥四季紅中含量較高的槲皮苷為考察指標(biāo)能較客觀地評價(jià)該新工藝，同時(shí)，經(jīng)過對新工藝、原工藝所制備樣品進(jìn)行藥效學(xué)比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2種工藝的藥物效應(yīng)并無顯著性差異，進(jìn)一步證明了該工藝的可行性，達(dá)到了多方面客觀評價(jià)的要求。

該工藝的改進(jìn)不僅可以節(jié)省能源，保護(hù)環(huán)境，還可以提高經(jīng)濟(jì)效益。吸附澄清劑用于中藥制劑的純化工藝已有報(bào)道，本研究中嘗試將其用于多種藥材提取液的純化工藝中，結(jié)果適用于很多藥材，但是不適用于含糖量較高的中藥材。

[1]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2003年版）[M].貴陽:貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2003:147.

[2]李孟林，梁斌.苗藥——頭花蓼研究綜述[J].中國醫(yī)院用藥評價(jià)與分析，2005，5(6):383－384.

[3]侯向明，王桂英.吸附澄清劑在中藥制劑中的應(yīng)用[J].天津藥學(xué)，2005，17(2):67－73.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:69.

[5]李敏，程敏.中藥車前草化學(xué)成分與藥理研究的新進(jìn)展[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2005，25(3):60－61.

[6]夏玲紅，金冠欽，孫黎，等.車前草的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥師，2013，16(2):294－295.

[7]王洪平，曹芳，楊秀偉，等.頭花蓼地上部分化學(xué)成分研究[J].中草藥，2013，44(1):24－30.

[8]荊文光，趙葉，張開霞，等.頭花蓼水提取物化學(xué)成分研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26(1):47－50.

[9]謝宇，張麗艷，梁斌，等.HPLC法測定頭花蓼及制劑熱淋清顆粒中槲皮苷的含量[J].中國中藥，2009，34(8):984－986.

[10]曹芳，段萍，王洪平，等.高效液相色譜法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素和槲皮苷的含量[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46(14):1972－1973.

[11]曹芳，譚輝，鄧先擴(kuò)，等.頭花蓼化學(xué)成分及其黃酮類化合物含量的研究進(jìn)展[J].黔南民族醫(yī)專學(xué)報(bào)，2012，25(2):121－125.

[12]何迅，龐秀清，李勇軍，等.殼聚糖用于頭花蓼水提液澄清工藝的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(12):3260－3262.

[13]劉謹(jǐn)，曹妹芳，李世芳.殼聚糖在金燈山根口服液制備中的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2003，9(4):5－7.

[14]李詠梅，龔元.頭花蓼的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].貴州大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24(2):205－207.

[15]張麗娟，王永林，王珍，等.頭花蓼活性組分化學(xué)成分研究[J].中藥材，2012，35(9):1425－1428.

[16]王開金，張穎君，楊崇仁，等.蓼屬植物的化學(xué)成分與生物活性成分研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（1）：151－164.