p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染在檢出宮頸癌及癌前病變中的作用*

張睿怡, 郭紅燕, 游珂, 郭艷利, 李子健, 耿力

100191 北京, 北京大學(xué)第三醫(yī)院 婦產(chǎn)科(張睿怡、郭紅燕、游珂、郭艷利、耿力),內(nèi)科(李子健)

宮頸癌的發(fā)病率居世界女性腫瘤中的第4位，是發(fā)展中國(guó)家婦女第2常見(jiàn)腫瘤，嚴(yán)重危害女性健康及生命[1]。我國(guó)患有宮頸癌的婦女人數(shù)高達(dá)13萬(wàn)，且患者發(fā)病年齡具有年輕化趨勢(shì)[2-3]。宮頸癌的篩查主要通過(guò)細(xì)胞學(xué)檢查進(jìn)行。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)影響細(xì)胞學(xué)檢查的因素較多，并有假陰性的問(wèn)題存在[4]。Schmidt等[5]用細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)又稱p16INK4a和細(xì)胞增殖標(biāo)記抗原Ki67(p16INK4a/Ki67)的免疫細(xì)胞化學(xué)雙染的方法檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)及宮頸癌，發(fā)現(xiàn)p16INK4a和Ki67同時(shí)表達(dá)可用作為宮頸鱗狀上皮細(xì)胞瘤變的一個(gè)指標(biāo)，提示宮頸高級(jí)別鱗狀上皮病變。為了探究宮頸上皮細(xì)胞p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染在檢出≥CIN2病變中的作用，我們選擇了2016年在我院門診進(jìn)行檢查的婦女作為研究對(duì)象，分別使用p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染色、宮頸細(xì)胞學(xué)和高危型HPV檢測(cè)進(jìn)行宮頸病變檢測(cè)，并以組織病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)3種方法在檢出高級(jí)別宮頸鱗狀上皮病變中的作用進(jìn)行了比較。

1 資料和方法

1.1 患者選擇

隨機(jī)選擇2016年6月至2017年1月在北京大學(xué)第三醫(yī)院婦科門診就診婦女153例，年齡20～73歲，平均年齡(39±10.74)歲，對(duì)每位婦女行宮頸細(xì)胞p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測(cè)、宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV檢測(cè)，并具有宮頸活檢組織病理學(xué)檢查結(jié)果。所有患者需遵循納入標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡大于20歲；2)有性生活史，但無(wú)妊娠；3)無(wú)子宮或子宮頸切除術(shù)史；4)無(wú)婦科腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)曾因?qū)m頸病變進(jìn)行治療者；2)無(wú)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果，或無(wú)高危型HPV檢測(cè)結(jié)果；3)無(wú)宮頸組織病理學(xué)診斷結(jié)果者。最終入組131位患者。

該研究已通過(guò)倫理委員會(huì)審查。入組患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

宮頸上皮細(xì)胞p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測(cè)采用CINtec PLUS細(xì)胞學(xué)試劑盒(Roche診斷產(chǎn)品公司，Newjersey,USA)，應(yīng)用BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀(Roche診斷產(chǎn)品公司，Newjersey, USA)進(jìn)行檢測(cè)，宮頸細(xì)胞學(xué)采用Thinprep(Hologic 公司，Massachusetts,USA)或Surepath(BD公司，Maryland, USA)液基薄片法，高危型HPV檢測(cè)采用Cobas 4800檢測(cè)系統(tǒng)(Roche診斷產(chǎn)品公司，Newjersey, USA)。以組織病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算3種方法檢出組織病理學(xué)為CIN2及以上病變的靈敏度、特異度、假陽(yáng)性率(誤診率)及假陰性率(漏診率)。根據(jù)靈敏度及特異度合成ROC曲線，計(jì)算曲線下面積(area under curve, AUC)。其中該研究中涉及的聯(lián)合檢測(cè)采用并聯(lián)試驗(yàn)方法進(jìn)行診斷。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

p16INK4a/Ki67雙染陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈紅色染色，且細(xì)胞質(zhì)呈棕色染色，僅細(xì)胞核顯色、僅細(xì)胞質(zhì)顯色或細(xì)胞均未顯色表示p16INK4a/Ki67雙染陰性，當(dāng)涂片中出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)雙染陽(yáng)性細(xì)胞時(shí)，即為該病例p16INK4a/Ki67雙染檢測(cè)陽(yáng)性[6]。細(xì)胞學(xué)檢查采用巴氏染色法，遵循TBS診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，當(dāng)細(xì)胞學(xué)檢查為無(wú)明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)及以上診斷結(jié)果時(shí)，判斷細(xì)胞學(xué)檢查陽(yáng)性。高危型HPV檢測(cè)[8]包括HPV16型，HPV18型，和其他12型HPV(31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66和68)。當(dāng)任意型別HPV陽(yáng)性時(shí)，判斷為高危型HPV檢測(cè)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示，靈敏度、特異度、誤診率及漏診率采用McNemarχ2檢驗(yàn)。采用MedCalc軟件比較p16INK4a/Ki67細(xì)胞雙染、宮頸細(xì)胞學(xué)及高危型HPV檢測(cè)的AUC。所有檢驗(yàn)結(jié)果以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測(cè)、宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及高危型HPV檢測(cè)檢出≥CIN2病變的比較

該研究共入組131位婦女，平均年齡(39±10.73)歲，其中慢性炎癥5例，CIN1患者29例，CIN2患者64例(包括局灶CIN2病變29例)，CIN3患者27例(包括局灶CIN3病變3例)，宮頸鱗癌6例。其中雙染陽(yáng)性患者共104例，陽(yáng)性率為79.4%。雙染陽(yáng)性結(jié)果如圖1所示。

分別計(jì)算3種方法檢出宮頸癌前病變及宮頸癌的靈敏度、特異度、漏診率、誤診率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，以組織病理診斷CIN2為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算三種檢測(cè)方法的AUC，AUC值越高，說(shuō)明該方法診斷越準(zhǔn)確(表1)。雙染檢出CIN2及以上病變的靈敏度及特異度(92.8%，58.8%)均高于細(xì)胞學(xué)檢查(82.5%，44.1%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然其靈敏度與高危型HPV檢測(cè)相近(94.8%)，但檢出≥CIN2病變的特異度明顯高于高危型HPV檢測(cè)(17.6%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。雙染檢測(cè)相比細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV檢測(cè)，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(84.5%)和陰性預(yù)測(cè)值(74.1%)最高。雙染的AUC為0.773，細(xì)胞學(xué)檢查AUC為0.633，高危型HPV檢測(cè)AUC為0.562，雙染與細(xì)胞學(xué)檢查、高危型HPV檢測(cè)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。提示雙染檢測(cè)檢出CIN2及以上病變的識(shí)別能力更好。

圖1 子宮頸脫落上皮細(xì)胞p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染圖片(×400)雙染陽(yáng)性細(xì)胞：胞質(zhì)呈棕色且胞核呈紅色染色(箭頭所示)A、B：雙染陽(yáng)性的單個(gè)細(xì)胞；C、D：雙染陽(yáng)性的細(xì)胞團(tuán)

表1 p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染、宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及高危型HPV檢測(cè)檢出宮頸病變的比較

注：*與p16INK4a/Ki67雙染相比，P<0.05，**與p16INK4a/Ki67雙染相比，P<0.01。

圖2 以組織病理診斷CIN2為金標(biāo)準(zhǔn)的 p16INK4a/Ki67雙染，細(xì)胞學(xué)及高危型HPV檢測(cè)的ROC曲線A. p16INK4a/Ki67雙染檢測(cè)ROC曲線; B. 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)ROC曲線; C. 高危型HPV檢測(cè)ROC曲線

2.2 聯(lián)合檢測(cè)檢出≥CIN2病變的比較

聯(lián)合檢測(cè)采用并聯(lián)試驗(yàn)方法，即當(dāng)兩種檢測(cè)方法有一種為陽(yáng)性時(shí)，診斷結(jié)果即為陽(yáng)性，當(dāng)兩種檢測(cè)方法均為陰性時(shí)，診斷結(jié)果為陰性。包括雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查、雙染聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)、細(xì)胞學(xué)聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)，分別計(jì)算聯(lián)合檢測(cè)檢出≥CIN2病變的結(jié)果(表2)。

雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查檢出全部≥CIN2病變的漏診(0/97)低于雙染聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)(2/97)。雖然其檢出率與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)相等，但雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)CIN2及以上病變過(guò)度診斷(25/34)最少。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，在32例細(xì)胞學(xué)無(wú)異常樣本中，高危型HPV陽(yáng)性率為90.9%(30/32)，其中僅2例細(xì)胞學(xué)無(wú)異常樣本的HPV為陰性；雙染檢測(cè)≥CIN2病變的檢出率為94.1%(16/17)，特異性為66.7%(10/15)。結(jié)果提示雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查檢出≥CIN2病變的漏診率和誤診率最低。

表2 聯(lián)合檢測(cè)檢出CIN2及以上宮頸病變的比較

注： hrHPV: High risk HPV，高危型HPV。

3 討 論

3.1 p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染提高檢出CIN2及以上病變的特異度

p16INK4a是一種細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑，參與細(xì)胞周期的調(diào)控。p16抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶介導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRB)的磷酸化激活，活化的pRB與轉(zhuǎn)錄因子E2F發(fā)生解離，游離的E2F參與細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)換，激活細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞增殖核抗原等，加速DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞分裂[9]。在細(xì)胞分裂間期，細(xì)胞低水平表達(dá)p16蛋白，有利于pRB與E2F重新結(jié)合，進(jìn)而使細(xì)胞周期停滯。但此時(shí)通過(guò)免疫化學(xué)方法在終末分化的上皮細(xì)胞中不能檢測(cè)p16表達(dá)水平[10]。當(dāng)機(jī)體持續(xù)高危型HPV病毒感染時(shí)，HPV基因與宿主基因發(fā)生整合，產(chǎn)生病毒致癌蛋白E7，E7蛋白能夠抑制pRB的活性，擾亂其與E2F的結(jié)合能力，破壞細(xì)胞周期循環(huán)，導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖，使得p16發(fā)生過(guò)表達(dá)[10-11]。Ki67是細(xì)胞增殖抗原，表達(dá)于細(xì)胞有絲分裂期，但在細(xì)胞間期不表達(dá)[12]。當(dāng)p16INK4a與Ki67蛋白在同一宮頸上皮細(xì)胞中同時(shí)檢出的時(shí)候，則提示細(xì)胞周期循環(huán)破壞，細(xì)胞異常增殖，可作為提示宮頸高級(jí)別鱗狀上皮病變的指標(biāo)[13]。我們的結(jié)果顯示，p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢出CIN2及以上宮頸病變靈敏度較高，且其特異度明顯高于細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV檢測(cè)，能夠降低誤診率，提高診斷陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。Wentzensen等[14]研究報(bào)導(dǎo)p16INK4a/Ki67雙染檢出子宮頸高級(jí)別鱗狀上皮病變靈敏度83.4%，特異度為58.9%，與我們的結(jié)果一致。

從20世紀(jì)50年代開(kāi)始，細(xì)胞學(xué)檢查方法開(kāi)始應(yīng)用于宮頸癌篩查，使得宮頸癌導(dǎo)致的病死率明顯下降。雖然細(xì)胞學(xué)檢查的方法和手段不斷改進(jìn)，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其檢出率并不十分令人滿意。因此，在全世界范圍，近10年來(lái)應(yīng)用高危型HPV檢測(cè)作為輔助篩查的手段改善篩查質(zhì)量，提高靈敏度。ATHENA實(shí)驗(yàn)[15]的數(shù)據(jù)提示采用HPV檢測(cè)可以更好地提高篩查靈敏度。但是，與大部分其他感染微生物(如沙眼衣原體或病菌)不同，感染HPV并不意味著患病，80%性活躍女性都可以感染HPV，且大多數(shù)HPV感染是一過(guò)性的。Schmidt等[5]研究表明，HPV檢測(cè)CIN2及以上病變靈敏度為96.4%，但特異度僅為19.1%。而年輕女性宮頸病變過(guò)度治療可能存在影響生育等問(wèn)題，對(duì)年輕女性的精神心理造成影響。據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)導(dǎo)，宮頸病變組織中p16INK4a的過(guò)表達(dá)與HPV感染有關(guān)，主要是由于HPV DNA整合于宿主基因，同時(shí)HPV癌基因E7誘導(dǎo)pRB功能失活從而使p16INK4a過(guò)表達(dá)。McLaughlin-Drubin等[17]的研究也證明HPV E7表達(dá)可觸發(fā)p16INK4a的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期依賴蛋白4/6 (cyclin-dependent kinases 4 and 6, CDK4/6)使細(xì)胞發(fā)生過(guò)度增殖。因此，與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和高危型rHPV檢測(cè)相比，p16INK4a/Ki67雙染能夠提示宮頸高級(jí)別鱗狀上皮病變，同時(shí)其p16過(guò)表達(dá)也可能提示HPV DNA與宿主細(xì)胞整合，從而排除HPV一過(guò)性感染，提高診斷的靈敏度與特異度。

3.2 p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染的聯(lián)合檢測(cè)能夠降低檢出CIN2及以上病變的漏診率

在入組的131位婦女中，p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查檢出全部97例≥CIN2病變，明顯降低病變檢出的漏診率，與雙染聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)及細(xì)胞學(xué)聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)相比，雙染與細(xì)胞學(xué)的聯(lián)合檢測(cè)降低了病例的過(guò)度診斷。PALMS的研究數(shù)據(jù)[18]顯示，在ASC-US及LSIL患者中，p16INK4a/Ki67雙染檢出CIN2及以上病變敏感度與HPV檢測(cè)相近，但其特異度高于高危型HPV檢測(cè)，并且雙染陽(yáng)性預(yù)測(cè)值有顯著升高。Yu等[19]研究報(bào)道，在高危型HPV陽(yáng)性婦女中，p16INK4a/Ki67雙染檢出高級(jí)別宮頸病變的敏感度及特異度(92.7%，52.7%)略低于細(xì)胞學(xué)檢查(94.5%，53.5%)，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們的研究通過(guò)比較聯(lián)合檢測(cè)的效果，發(fā)現(xiàn)雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)特異度高于細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV檢測(cè)，結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相一致。在細(xì)胞學(xué)檢查陰性的病例中，p16INK4a/Ki67雙染能夠更好地鑒別CIN2及以上病變，減少漏診和過(guò)度診斷，進(jìn)而減少過(guò)度醫(yī)療，減少醫(yī)療資源浪費(fèi)。因此，在檢出CIN2及以上病變中，p16INK4a/Ki67雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)具有更高的靈敏性，降低了子宮頸高級(jí)別鱗狀上皮病變的漏診率，可以彌補(bǔ)單純細(xì)胞學(xué)檢查的不足。

3.3 p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染出現(xiàn)漏診或誤診的影響因素

雖然免疫細(xì)胞雙染檢測(cè)能夠提高≥CIN2病變的檢出，但仍有一定的漏診率和誤診率。Edgerton等[20]的研究說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的制片方法及質(zhì)量可能影響判讀結(jié)果，本研究雙染制片中存在細(xì)胞稀疏和細(xì)胞團(tuán)塊，因此可能造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)由于閱片經(jīng)驗(yàn)不足，也可能導(dǎo)致雙染誤判[21]。本研究中共有32例組織病理診斷為局灶病變(其中29例為局灶性CIN2病變，3例為局灶性CIN3病變)，其中細(xì)胞學(xué)檢查為陰性8例，雙染檢測(cè)陰性3例。雙染的漏診率小于細(xì)胞學(xué)檢查，提示在檢出局灶病變中，雙染可能具有一定的優(yōu)勢(shì)。其漏診的原因可能由于病變部位較小，刷取的雙染異常細(xì)胞數(shù)量較少或缺失導(dǎo)致雙染假陰性。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意制片質(zhì)量，同時(shí)閱片醫(yī)生需要進(jìn)行一定培訓(xùn)，并由多位醫(yī)生重復(fù)閱片，以增加雙染結(jié)果判讀的正確性。

本研究尚存在一定局限性，入組病例數(shù)還不足且只是綜合醫(yī)院門診病例，其代表性有限，需要大樣本量研究的支持與驗(yàn)證。同時(shí)所有陽(yáng)性病例中，僅1位患者為腺上皮病變(未入組)，其雙染結(jié)果為陽(yáng)性，其他入組病例均為鱗狀上皮病變，因此，尚不能說(shuō)明p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞雙染的方法對(duì)于宮頸腺癌的檢出作用。綜上所述，本研究提示，與細(xì)胞學(xué)檢查相比，p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染在檢出宮頸高級(jí)別鱗狀上皮病變及宮頸鱗癌時(shí)具有較高的靈敏度、特異度；與HPV檢測(cè)相比，p16INK4a/Ki67細(xì)胞雙染誤診病例數(shù)更少；同時(shí)在聯(lián)合檢測(cè)中，雙染聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)能夠提高宮頸高級(jí)別鱗狀上皮病變及宮頸鱗癌檢出的敏感度及特異度。因此，p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染有助于減少宮頸病變檢出的過(guò)度診斷，彌補(bǔ)診斷不足，提高宮頸病變的辨識(shí)度，減少過(guò)度醫(yī)療。

作者聲明：本文第一作者對(duì)于研究和撰寫(xiě)的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無(wú)相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測(cè)；

同行評(píng)議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

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