鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響*

遲笑怡， 胡凱文， 周天， 遲佳琦， 王琳， 楊新階

100078 北京，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 腫瘤科

腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲已成為惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征，是導(dǎo)致臨床多數(shù)腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。超過(guò)60%的患者在診斷明確時(shí)已經(jīng)有顯性或隱性的轉(zhuǎn)移灶存在。原發(fā)腫瘤可通過(guò)手術(shù)切除、放射治療或其他局部治療加以有效控制，但已播散的腫瘤用上述手段治療往往難以控制病情的進(jìn)一步發(fā)展。確切的證據(jù)表明：超過(guò)90%的癌癥患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移[1]。因此能否有效阻止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療成敗的關(guān)鍵。

隨著腫瘤診療水平的不斷提高，對(duì)于處理腫瘤原發(fā)灶方面已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移方面目前尚未發(fā)現(xiàn)有效可靠的藥物和方法，隨著細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的深入研究及新的腫瘤治療途徑和靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在抗轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯，而其中活血化瘀中藥的應(yīng)用占了相當(dāng)比例。鹽酸川芎嗪是從中藥川芎中提取的一種活性生物堿-四甲基吡嗪，具有活血化瘀、抗血小板凝集、改善微循環(huán)等多種功效，近年抗腫瘤作用也日益受到關(guān)注[2-3]。順鉑是傳統(tǒng)的化療藥物, 應(yīng)用于多種腫瘤, 但單獨(dú)使用后期易出現(xiàn)耐藥。有研究研究表明, 化療藥物與川芎嗪聯(lián)合應(yīng)用, 可提高治療惡性腫瘤的療效。實(shí)驗(yàn)研究鹽酸川芎嗪(TMP)聯(lián)合順鉑(DDP)對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(LLC-GFP)購(gòu)于安泰康(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 藥物與試劑 注射用鹽酸川芎嗪(TMP)，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(產(chǎn)品批號(hào)：151004E2)；注射用順鉑(DDP)，齊魯制藥(海南)有限公司， 購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥劑科(產(chǎn)品批號(hào)：2A1A1511018B)；青鏈霉素混合液(100×)、胰蛋白酶-EDTA混合液購(gòu)于Invitrogen公司(貨號(hào)：15140122、25200056)；4%多聚甲醛購(gòu)于索萊寶公司(貨號(hào)：P1110-500)；結(jié)晶紫染色液購(gòu)于Genebio公司(貨號(hào)：bw-g0046)；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于同仁化學(xué)(貨號(hào)：CK04)；MTT細(xì)胞增值及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于索萊寶公司(貨號(hào)：M1020-500)；Transwell小室購(gòu)于Corning公司(貨號(hào)：3422)；Basement Membrane Matrix、Fibronectin購(gòu)于BD公司(貨號(hào)：356234、354008)；Laminin購(gòu)于sigma公司(貨號(hào)：L2020-1MG)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于索萊寶公司(貨號(hào)：CA1020、PC0020)；GAPDH monoclonal antibody、E-cadherin polyclonal antibody購(gòu)于proteintech公司(貨號(hào)：60004-1-Ig、2087-1-AP)；Goat Anti-Rabbit IgG H+L、Goat Anti-Mouse IgG H+L購(gòu)于中杉金橋公司(貨號(hào)：ZB-2301、ZB-2305)。

1.1.3 主要儀器 HDL潔凈工作臺(tái)：購(gòu)自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：Thermo公司；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：3K15型，購(gòu)自德國(guó)SIGMA公司；光譜掃描多功能酶標(biāo)儀：Promega公司；倒置相差顯微鏡：購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司；電泳儀：購(gòu)自BIORAD公司；Tanon全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)：4200型，購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 綠色熒光蛋白標(biāo)記(GFP)的小鼠Lewis肺癌(LLC-GFP)細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM(高糖)培養(yǎng)基置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察其生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥品配制 鹽酸川芎嗪的配制：用PBS將注射用鹽酸川芎嗪配制成濃度100mg/mL的儲(chǔ)存液，4℃保存?zhèn)溆?，用前稀釋至所需濃度。順鉑的配制：用PBS將注射用順鉑配制成濃度1mg/mL的儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆茫们跋♂屩了铦舛取?/p>

1.2.3 分組 根據(jù)藥物濃度，分別將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(control)、陽(yáng)性藥物順鉑組(DDP)、鹽酸川芎嗪高、中、低劑量組(TMP)、鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑高、中、低劑量組(TMP+DDP)。其中順鉑藥物濃度通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定為1μg/mL，以下用(DDP，1μg/mL)表示。鹽酸川芎嗪藥物濃度根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。藥物處理時(shí)間24h。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)TMP對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響，確定TMP給藥濃度 待細(xì)胞融合度達(dá)到90%后棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL，將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔100μL。細(xì)胞貼壁后，各實(shí)驗(yàn)組孔分別加入含500μg/mL、1000μg/mL、1500μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mL的TMP進(jìn)行干預(yù)，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h后進(jìn)行增殖能力的檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)每孔加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中1h。采用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，計(jì)算各組抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值)] ×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定TMP高、中、低劑量組及TMP+DDP高、中、低劑量組藥物濃度。

1.2.5 TMP聯(lián)合DDP對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC-GFP細(xì)胞，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至75%以上時(shí)，加入TMP及DDP處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為(1)空白對(duì)照組(control)：不加藥物處理；(2)DDP組；(3)TMP組：分為TMP高、中、低劑量三組；(3)TMP+DDP組：分為TMP+DDP高、中、低劑量三組。各組細(xì)胞加入不同濃度藥物干預(yù)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下(放大倍數(shù)為200倍)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。

1.2.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 在Transwell小室上室面加入100μL用DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel(體積稀釋比例為1:8)，下室面用移液槍頭涂抹Fibronectin(濃度0.5mg/mL)，置于37℃培養(yǎng)箱中包被2h，使Matrigel凝固成膠，4℃過(guò)夜風(fēng)干。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC-GFP細(xì)胞，加入TMP及DDP處理細(xì)胞(分組情況參考2.3)，用藥干預(yù)24h。接種細(xì)胞前拿出小室，吸出小室中殘余液體，每小室加入100μL DMEM，37℃孵育30min，水化基底膜。收集各組細(xì)胞，重懸于不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)細(xì)胞/mL。將各組細(xì)胞接種于Transwell小室的上室中，接種體積為200μL(1×104個(gè)細(xì)胞)，下室中加入600μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)24h后取出小室，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛，室溫固定15min，PBS洗2次，用棉簽擦拭小室上室面未穿過(guò)小室膜的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色15min后，在倒置顯微鏡(放大倍數(shù)為200倍)下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，每小室選擇上下左右中共10個(gè)視野，對(duì)每組的10個(gè)視野的圖片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

1.2.7 人造基底膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的黏附能力 分別用Matrigel(用DMEM培養(yǎng)基稀釋，體積稀釋比例為1:8)、Fibronectin(0.5mg/mL)、Laminin(40ug/mL)、BSA(10g/L)包被96孔板，置于37℃培養(yǎng)箱包被2h，后放入4℃過(guò)夜風(fēng)干備用，BSA為對(duì)照基底。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC-GFP細(xì)胞，加入TMP及DDP處理細(xì)胞(分組情況參考2.3)，用藥干預(yù)24h。接種前吸出96孔板中殘余液體，每孔加入50μL DMEM，37℃孵育30min，水化基底膜。收集各組細(xì)胞，重懸于不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)細(xì)胞/mL。將各組細(xì)胞懸液接種于96孔板中，接種體積為100μL(5×103個(gè)細(xì)胞)，每組設(shè)3個(gè)平行孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)120min后取出96孔板，用移液槍吸出培養(yǎng)液，PBS洗3遍，除去未黏附的腫瘤細(xì)胞。分別加入MTT 100μL/孔，37℃溫箱內(nèi)孵育4h，吸棄MTT，加入DMSO 200μL/孔溶解甲臜，于振蕩器上輕輕震蕩10min，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔OD值。計(jì)算各組細(xì)胞在Matrigel、Fibronectin、Laminin上的黏附率。計(jì)算公式：黏附率%=[(Matrigel或Fibronectin或Laminin組細(xì)胞OD值/BSA組細(xì)胞OD值)-1] ×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

1.2.8 Western Blot檢測(cè)E-cadherin的蛋白表達(dá) 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC-GFP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至75%以上時(shí)，按分組要求(分組情況參考2.3)加入相應(yīng)濃度的TMP及DDP干預(yù)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液(RIPA：PMSF=100:1)，用細(xì)胞刮刀刮下，收集至離心管，冰上裂解25min后，12000g，4℃，離心10min，取上清液為蛋白樣品，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液，置于100℃水浴中變性5min。SDS-PAGE分離蛋白，根據(jù)目的蛋白的相對(duì)分子量配制相應(yīng)的分離膠濃度(10%)。加樣后分別進(jìn)行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉常溫封閉1.5h后，分別加入一抗GAPDH(1:5000)、E-cadherin(1:1000)4℃反應(yīng)過(guò)夜。TBST洗膜7次，5min/次；根據(jù)一抗的種屬選擇相應(yīng)的二抗(山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG，稀釋比例為1:10000)室溫孵育1.5h。最后ECL發(fā)光、顯影、拍照。相對(duì)蛋白含量用各蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值來(lái)表示。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 TMP對(duì)LLC-GFP細(xì)胞增殖的影響，確定TMP給藥濃度

CCK-8結(jié)果顯示，TMP對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著TMP藥物濃度的升高，其增殖的抑制率也增高。TMP濃度為500μg/mL～2000μg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比，LLC-GFP細(xì)胞的增殖受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TMP濃度為2500μg/mL時(shí)，與對(duì)照組相較，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，分別選擇TMP 500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL三個(gè)濃度作為TMP低、中、高劑量組。見(jiàn)圖1、表1。以下TMP低、中、高劑量組分別用(TMP 500)、(TMP 1000)、(TMP 2000)表示。TMP+DDP低、中、高劑量組分別用(TMP+DDP 500+1)、(TMP+DDP 1000+1)、(TMP+DDP 2000+1)表示。

圖1 CCK-8測(cè)定TMP對(duì)LLC-GFP細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 TMP+DDP對(duì)LLC-GFP細(xì)胞形態(tài)的影響

各組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)24h后，可見(jiàn)對(duì)照組LLC-GFP細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間排列緊密，可融合成集落。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞隨藥物濃度的增高細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形，突起減少，輪廓變模糊；其中TMP 500組、TMP 1000組、TMP+DDP 500+1組細(xì)胞形態(tài)基本正常，僅有少量細(xì)胞變?yōu)閳A形；DDP組、TMP 2000組、TMP+DDP 1000+1組及TMP+DDP 2000+1組細(xì)胞形態(tài)明顯改變，由具有較高侵襲能力的細(xì)長(zhǎng)梭形變?yōu)榍忠u能力較弱的圓形，細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞見(jiàn)細(xì)胞核固縮，胞體折光性降低，胞漿濃縮，胞漿內(nèi)可見(jiàn)顆粒和碎片，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，GFP熒光強(qiáng)度明顯減弱。見(jiàn)圖2。

表1 CCK-8測(cè)定TMP對(duì)LLC-GFP細(xì)胞增殖的抑制作用

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01，***P<0.01

圖2 倒置光學(xué)顯微鏡下觀察不同處理組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×200)橫向第一行、第三行代表control組及經(jīng)DDP、TMP 500、TMP 1000、TMP 2000、TMP+DDP 500+1、TMP+DDP 1000+1、TMP+DDP 2000+1藥物干預(yù)后細(xì)胞在明場(chǎng)中的形態(tài)變化；橫向第二行、第四行代表各組細(xì)胞GFP的表達(dá)情況

2.3 TMP+DDP對(duì)LLC-GFP細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均能夠穿過(guò)鋪有人工基質(zhì)Matrigel的濾膜，且各實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比，差異明顯(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，隨著TMP濃度的增高，細(xì)胞侵襲數(shù)逐漸減少，侵襲抑制作用逐漸增強(qiáng)，TMP+DDP組較單獨(dú)使用DDP及TMP組侵襲抑制作用更為明顯， TMP+DDP 組穿過(guò)膜面細(xì)胞不但數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)也有較大改變，多數(shù)呈圓形，正常細(xì)胞形態(tài)缺失。見(jiàn)圖3、表 2。

圖3 不同濃度TMP聯(lián)合DDP對(duì)于LLC-GFP細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

圖A為各組細(xì)胞Transwell小室倒置顯微鏡視野下所見(jiàn)結(jié)果；圖B為Transwell小室結(jié)果分析；可見(jiàn)隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞侵襲數(shù)逐漸減少，TMP+DDP組較單獨(dú)使用DDP及TMP組侵襲抑制作用更為明顯，與對(duì)照組相比，**P<0.01，n=2

表2 TMP聯(lián)合DDP對(duì)于LLC-GFP細(xì)胞侵襲能力的影響

注: 與對(duì)照組相比，**P<0.01

2.4 TMP+DDP對(duì)LLC-GFP細(xì)胞黏附的影響

腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相關(guān)成分(如Laminin、Fibronectin)的相互黏著，是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)[4]。人工基底膜膠Matrigel、Fibronectin及Laminin具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附的作用。結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組黏附抑制率均高于對(duì)照組，不同基底膜成分(Matrigel、Fibronectin、Laminin)在TMP低、中劑量組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DDP組黏附抑制率在不同基底膜成分與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TMP聯(lián)合DDP劑量組與單獨(dú)應(yīng)用DDP及TMP相比較，黏附抑制率更加明顯(P<0.01)，說(shuō)明TMP及DDP均對(duì)LLC-GFP細(xì)胞的黏附產(chǎn)生抑制作用，聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用效果更佳，且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖4、表3。

圖4 TMP聯(lián)合DDP對(duì)于LLC-GFP細(xì)胞黏附能力的影響

A.各組細(xì)胞在Matrigel基底膜成分對(duì)于細(xì)胞黏附能力的影響；B.各組細(xì)胞在Fibronectin基底膜成分對(duì)于細(xì)胞黏附能力的影響；C.各組細(xì)胞在Laminin基底膜成分對(duì)于細(xì)胞黏附能力的影響；與對(duì)照組相比，**P<0.01，n=2

2.5 TMP+DDP對(duì)LLC-GFP細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

本研究采用蛋白印跡法檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)。蛋白印跡法結(jié)果顯示，TMP中、高劑量組可明顯上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)(與對(duì)照組相比，中劑量組P<0.05，高劑量組P<0.05)，而TMP聯(lián)合DDP各劑量組均可上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)(P<0.01)，TMP+DDP組在上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)方面優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用DDP及TMP組。見(jiàn)圖 5、表4。

表3 TMP聯(lián)合DDP對(duì)于LLC-GFP細(xì)胞黏附能力的影響

注: 與對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01

圖5 TMP聯(lián)合DDP對(duì)于LLC-GFP細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)的影響

TMP中、高劑量組可明顯上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，而TMP聯(lián)合DDP各劑量組均可上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)；*P<0.05，**P<0.01；n=2(1.control; 2.DDP; 3.TMP 500; 4.TMP 1000; 5.TMP 2000; 6.TMP+DDP 500+1; 7.TMP+DDP 1000+1; 8.TMP+DDP 2000+1)

表4 TMP聯(lián)合DDP對(duì)于LLC-GFP細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)的影響

注: 與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多基因參與的過(guò)程，目前認(rèn)為，主要包括以下幾個(gè)連續(xù)的過(guò)程：首先，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，通過(guò)細(xì)胞表面受體與基底膜(BM)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)中的蛋白質(zhì)黏附，黏連侵襲基底膜并在周圍間質(zhì)中浸潤(rùn)生長(zhǎng)；然后與局部毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞密切接觸并穿過(guò)ECM和脈管壁進(jìn)入血液或者淋巴循環(huán)，在循環(huán)中運(yùn)行并逃避免疫系統(tǒng)攻擊；再穿出脈管壁達(dá)到繼發(fā)部位，與繼發(fā)部位組織黏附，形成克隆并增生生長(zhǎng)，繼而促發(fā)微血管生成，最終形成轉(zhuǎn)移灶[4]。

上皮源性的腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生所需的起始事件[5-6]。具有極性的上皮細(xì)胞失去其上皮形態(tài)，轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，這種表型的轉(zhuǎn)換使得腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞-細(xì)胞間連接而表現(xiàn)得更具侵襲性。這一過(guò)程同時(shí)伴隨細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞間黏附作用的減弱等改變，腫瘤細(xì)胞由此獲得從原位向周圍侵襲的能力，最終通過(guò)血液和淋巴途徑轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處形成新的病灶[7-8]。在此過(guò)程中，E-鈣黏素(E-cadherin)發(fā)揮著尤為重要的作用。E-cadherin是維持上皮表型的重要粘附分子，在細(xì)胞間粘附與維持細(xì)胞極性方面起著重要的作用。E-cadherin的表達(dá)量及穩(wěn)定性是EMT發(fā)生的關(guān)鍵[9]，正常組織中的E-cadherin表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，但在惡性腫瘤組織中其表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力成負(fù)相關(guān)，E-cadherin表達(dá)的下調(diào)使腫瘤細(xì)胞同質(zhì)性黏附以及錨定能力下降，以腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)并穿透基底膜為表現(xiàn)獲得運(yùn)動(dòng)及向遠(yuǎn)處侵襲的能力。多項(xiàng)研究顯示，上調(diào)E-cadherin，中斷或逆轉(zhuǎn)EMT，可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率[10]。

在腫瘤的成因及防治方面，中國(guó)醫(yī)學(xué)也不斷地在進(jìn)行深入的思考及有益的猜想。殷商時(shí)代的“瘤”字即體現(xiàn)了當(dāng)時(shí)人們對(duì)于腫瘤“瘀阻積滯留聚不去，難以自行消散”特點(diǎn)的認(rèn)知。因此，活血化瘀的中藥在中醫(yī)治療惡性腫瘤中的應(yīng)用十分廣泛，中藥川芎即是其中的代表藥物之一。鹽酸川芎嗪是傳統(tǒng)中醫(yī)藥川芎的有效提取物，除具有抗血栓、改善微循環(huán)及血液流變學(xué)等作用外，近年來(lái)研究表明，也可作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。賈秀紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，沉默內(nèi)源性凋亡抑制基因Apollon可抑制白血病細(xì)胞K562的增殖，促進(jìn)其凋亡，與川芎嗪聯(lián)合使用后作用顯著增強(qiáng)。張加軍等[12]的研究結(jié)果顯示，川芎嗪可有效抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖，且此抑制作用呈時(shí)間及劑量依賴性，其機(jī)制可能與抑制突變型p53蛋白的表達(dá)有關(guān)。降解基底膜是腫瘤細(xì)胞脫離原病灶和向間質(zhì)浸潤(rùn)的必要條件，是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生的起始事件。殷娟等[13]發(fā)現(xiàn)，外源性白介素-8(IL-8)有促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移能力的作用，而川芎嗪可通過(guò)下調(diào)MMP-9及E-cadherin的蛋白表達(dá)抑制此作用。

本研究采用鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑共同干預(yù)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定順鉑的用藥濃度，及給藥時(shí)間。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)確定鹽酸川芎嗪的用藥濃度，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、順鉑組、鹽酸川芎嗪組及鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑組，用藥24小時(shí)后觀察各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用。腫瘤細(xì)胞具有體積大、胞核增大等特點(diǎn)，而本實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)TMP及DDP干預(yù)24小時(shí)后，與對(duì)照組相比各實(shí)驗(yàn)組Lewis細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，由具有較高侵襲能力的細(xì)長(zhǎng)梭形變?yōu)榍忠u能力較弱的圓形，細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞見(jiàn)細(xì)胞核固縮，胞體折光性降低，胞漿濃縮，胞漿內(nèi)可見(jiàn)顆粒和碎片，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，尤以DDP與TMP聯(lián)合組抑制作用更為明顯。

腫瘤細(xì)胞的黏附與侵襲包括腫瘤細(xì)胞之間的同質(zhì)性黏附、腫瘤細(xì)胞與基底膜和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的異質(zhì)性黏附，一方面腫瘤細(xì)胞必須先從原黏附的原發(fā)灶脫離，才能發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移；另一方面，腫瘤細(xì)胞需要黏附在基質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞上，進(jìn)入血液循環(huán)，才可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，增加腫瘤之間的同質(zhì)性黏附，降低腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性黏附，可能是抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的有效機(jī)制[14]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)直接觀察鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，同時(shí)運(yùn)用人造基底膜實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性黏附的影響，間接反映藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞侵襲能力的作用。結(jié)果顯示單獨(dú)使用TMP及DDP均可抑制Lewis肺癌細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)，而將兩藥聯(lián)合使用，效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，不但可明顯抑制侵襲轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)量，還明顯改變了侵襲細(xì)胞的形態(tài)，進(jìn)一步降低其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。而人造基底膜實(shí)驗(yàn)觀察到，單獨(dú)應(yīng)用DDP可有效抑制腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性黏附(P<0.05)，單獨(dú)使用TMP則需將濃度提高至2 000μg/mL才可明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性黏附，而DDP聯(lián)合TMP在低劑量組即可觀察到對(duì)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性黏附有明顯的抑制作用(P<0.01)，因此我們可以推斷，鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑具有抑制腫瘤侵襲能力的作用，較單獨(dú)應(yīng)用鹽酸川芎嗪或順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲抑制作用效佳，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

腫瘤細(xì)胞之間的黏附稱為同質(zhì)性黏附，同質(zhì)性黏附下降可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從瘤體上脫落進(jìn)而發(fā)生腫瘤的早期轉(zhuǎn)移，E-cadherin在此過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，E-cadherin在細(xì)胞分裂黏附和腫瘤早期浸潤(rùn)中有調(diào)控作用，其表達(dá)下調(diào)或缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞失去接觸抑制，細(xì)胞間連接松散，易脫落，表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲能力[15-18]。因此我們利用蛋白免疫印跡(Western Blotting)的方法檢測(cè)TMP與DDP干預(yù)后Lewis肺癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示單獨(dú)應(yīng)用鹽酸川芎嗪中、高劑量組可上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，且呈濃度依賴性，高劑量組較中劑量組上調(diào)E-cadherin的程度更為明顯(P<0.01)；單獨(dú)應(yīng)用DDP上調(diào)E-cadherin的程度與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩藥聯(lián)合則能明顯上調(diào)E-cadherin的水平(P<0.01)，可見(jiàn)中藥聯(lián)合陽(yáng)性藥物組對(duì)于E-cadherin的上調(diào)作用整體優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用中藥及陽(yáng)性藥物組。因此，我們推測(cè)鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑可以改變Lewis肺癌的細(xì)胞形態(tài)、抑制其增殖，降低細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力, 同時(shí)上調(diào)黏附分子E-cadherin的蛋白表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)性黏附能力,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)之間的異質(zhì)性黏附，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的目的。

綜上所述，鹽酸川芎嗪聯(lián)合順鉑可在多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，這為活血化瘀中藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移及其作用機(jī)制提供了重要依據(jù)，為防治腫瘤轉(zhuǎn)移展示了良好的前景。

作者聲明：本文第一作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無(wú)相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測(cè)；

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