石香薷總黃酮調(diào)味品的制備

羅曉，呼海濤，龔海燕，陳志紅，崔永霞，吳明俠

(河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046)

石香薷(MoslachinensisMaxim.)是唇形科(Labiatae)薺苧屬 (Molsa) 植物，2002年被衛(wèi)生部認(rèn)定為藥食兩用為藥。香薷作為藥食同源的藥材，具有很好的實(shí)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，食療將是未來(lái)研究的重點(diǎn)，可以開(kāi)發(fā)為香薷飲料或者日常生活的調(diào)味品，在祛濕方面有良好功效[1,2]，主產(chǎn)于河南、湖北、安徽、浙江、江西等省。始載于《名醫(yī)別錄》：“味辛甘，性微溫，歸肺、胃經(jīng)。具有發(fā)汗解表、行水散濕、溫胃調(diào)中的功效[3,4]?！爆F(xiàn)代研究表明：石香薷具有抗病原微生物作用[5-7]，抗炎及解熱作用，鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用和增強(qiáng)免疫作用的藥理活性[8]。

香薷的研究主要集中在揮發(fā)性成分的研究。而非揮發(fā)性物質(zhì)，主要是黃酮類成分，目前主要從石香薷中分離出9個(gè)黃酮類化合物[9-11]。超聲波提取法具有快速、提取率高、節(jié)能減耗、不破壞有效成分的特點(diǎn)。本試驗(yàn)采用超聲波法提取石香薷中的總黃酮，正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測(cè)定總黃酮的含量[12-17]。該試驗(yàn)制作石香薷總黃酮調(diào)味品，并為藥食兩用藥石香薷的藥用和食用開(kāi)發(fā)提供一定的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石香薷：購(gòu)于鄭州市東升大藥房，產(chǎn)于河南，亳州市遠(yuǎn)光中藥飲片廠生產(chǎn)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室劉孟奇副教授鑒定為唇形科香薷屬植物石香薷。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)：中國(guó)藥品生物制品鑒定所。水為二次蒸餾水，乙醇為醫(yī)用級(jí)，其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PB1502-L型電子天平 瑞士梅特勒公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；ZRD-8210型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；GF254型硅膠薄層板 青島海洋化工廠；大孔吸附樹(shù)脂(AB-8和DM-130) 安徽三星樹(shù)脂有限公司；聚酰胺柱材料(60～100目) 泰州路橋生化有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D循環(huán)式真空泵 鞏義英峪裕華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

樣品：將購(gòu)買的石香薷，曬干，粉碎，過(guò) 100 目篩，置于棕色瓶?jī)?nèi)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：105 ℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，稱量 5.07 mg，用40%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)溶解、定容至25 mL，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.2028 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 mL于10 mL的比色管中，各加入0.4 mL 5% NaNO2溶液，0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻放置5 min，加入2 mL 4% NaOH溶液，再用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇定容，以溶劑做空白，在波長(zhǎng)為504 nm下，測(cè)吸光度值(A)。計(jì)算得線性回歸方程為：A=12.436 c-0.017，相關(guān)系數(shù)r=0.9977(n=7)，在0～70 mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

1.3.3 超聲波法提取石香薷中的總黃酮

準(zhǔn)確稱量1.0000 g 的石香薷，加入指定濃度的乙醇、指定的液料比，超聲波法提取指定的時(shí)間，過(guò)濾定容至50 mL。

1.3.4 總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取石香薷總黃酮提取液0.30 mL于10 mL比色管中，按照測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的方法測(cè)定樣品的吸光度值。將吸光度值A(chǔ)代入線性回歸方程求得總黃酮含量。

1.3.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝條件

將樣品按照1.3.3的提取方法，分別考察乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間等單因素對(duì)石香薷總黃酮含量的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)而考察各因素對(duì)總黃酮含量的相互影響，選定三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(34)。優(yōu)化石香薷中總黃酮的提取工藝條件。

1.3.6 石香薷總黃酮調(diào)味品的制備

按照優(yōu)化石香薷總黃酮的提取工藝提取原料液，進(jìn)行柱層析，經(jīng)優(yōu)化合適的柱材料和洗脫劑，濃縮制備石香薷總黃酮調(diào)味品。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)石香薷總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g石香薷，在液料比為20∶1(mL/g)，時(shí)間為1.5 h，分別用20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%濃度的乙醇超聲提取石香薷總黃酮，按照1.3的方法測(cè)定吸光度值A(chǔ)并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate

由圖1可知，石香薷總黃酮提取率隨乙醇濃度增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)濃度在40%左右時(shí)有最高值，這可能與黃酮類物質(zhì)本身的極性有關(guān)。

2.1.2 液料比對(duì)石香薷總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g石香薷，乙醇濃度為40%，時(shí)間為1.5 h，分別用液料比 5∶1，10∶1，20∶1，30∶1，50∶1，60∶1超聲提取石香薷總黃酮，按照1.3的方法測(cè)定吸光度值A(chǔ)并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate

由圖2可知，石香薷總黃酮提取率隨液料比的增大呈先增大后趨于平緩的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為20∶1(mL/g)時(shí)提取率達(dá)到最高。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)石香薷總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.0000 g石香薷，乙醇濃度為40%，液料比為20∶1，分別選擇 10，20，30，40，50，60 min 超聲提取，按照1.3的方法測(cè)定吸光度值A(chǔ)并計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of time on extraction rate

由圖3可知，石香薷總黃酮提取率隨提取時(shí)間增加呈現(xiàn)增幅較大然后增幅變緩后趨于平穩(wěn)的態(tài)勢(shì)，故單因素試驗(yàn)選擇超聲提取為30 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇適當(dāng)?shù)囊掖紳舛?、液料比和提取時(shí)間，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

超聲法提取石香薷中的總黃酮，采用正交試驗(yàn)方法確定優(yōu)化的工藝條件，并測(cè)定其含量。

準(zhǔn)確稱取樣品1.0000 g共9份，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)表在相應(yīng)的條件下超聲提取，得黃酮提取液，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)并計(jì)算提取率。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，各因素的極差分別為 5.008，1.655，2.231，表明采用超聲法對(duì)石香薷總黃酮提取率的影響次序是A>C>B，即乙醇濃度>時(shí)間>液料比，A2B1C3，即優(yōu)化方案為40%乙醇，液料比20，超聲提取40 min。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 The results of variance analysis of orthogonal experiment

注：F0.10(2,2)=9.00；F0.05(2,2)=19.00。

由表3可知，F(xiàn)B=1.19

3 石香薷總黃酮的提取

精密稱量樣品1.0000 g，在A2B1C3水平，即40%乙醇，液料比20，超聲提取40 min條件下，按上述1.3的方法測(cè)定吸光度值A(chǔ)并計(jì)算提取率。重復(fù)測(cè)定3個(gè)樣品，石香薷總黃酮的提取率分別為61.74，61.80，61.98 mg/g，平均值為61.84 mg/g，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)Table 4 Test of repeated verification mg/g

4 石香薷總黃酮調(diào)味品的制備

4.1 富集總黃酮的柱材料選擇

精密稱量樣品100 g共3份，按照上述1.3的方法，提取石香薷中的總黃酮，得到總乙醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至無(wú)醇，加入一定量的水，過(guò)濾，呈澄清透明狀的溶液。分別濕法上大孔吸附樹(shù)脂AB-8，DM-130和聚酰胺柱子，然后分別用水、10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%的乙醇沖洗，收集洗脫液并蒸發(fā)至干，經(jīng)TLC板檢測(cè)，合并總黃酮部分。發(fā)現(xiàn)聚酰胺柱子對(duì)于富集石香薷中總黃酮調(diào)味品的效果較好。

4.2 調(diào)味品的制備

精密稱量樣品100 g共3份，按照上述1.3和4.1的方法提取得到澄清透明的溶液，以聚酰胺為柱材料，濕法上樣，分別用水、10%乙醇、50%的乙醇為洗脫劑，收集50%乙醇部分并蒸干，該蒸干黃色粉末部分即為石香薷總黃酮調(diào)味品。關(guān)于該調(diào)味品的成分有待進(jìn)一步深入的研究。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)以石香薷為研究對(duì)象，采用超聲法提取，正交試驗(yàn)法優(yōu)化石香薷總黃酮的提取工藝條件，利用紫外-可見(jiàn)分光光度法在波長(zhǎng)504 nm處測(cè)定其吸光度并計(jì)算其含量，結(jié)合柱層析法制作調(diào)味品。結(jié)果表明：乙醇濃度是影響超聲法提取石香薷總黃酮的主要因素，優(yōu)化的工藝條件為40%乙醇，液料比20，超聲提取40 min，此時(shí)總黃酮的含量為61.84 mg/g，以聚酰胺為柱材料，50%乙醇洗脫液蒸干，得到的黃色粉末即為調(diào)味品。該工藝簡(jiǎn)單易行，收率高，可用于石香薷中總黃酮的提取以及石香薷調(diào)味品的制備，并為開(kāi)發(fā)食用、藥用等石香薷資源提供一定的技術(shù)參數(shù)。

[1]李敏，苗明三.香薷的化學(xué)、藥理與臨床應(yīng)用特點(diǎn)分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2015(4):578-579.

[2]彭旋，萬(wàn)春鵬，鄭嘉鵬，等.香薷復(fù)合涂膜對(duì)新余蜜橘常溫貯藏效果的研究[J].食品科技，2016,41(5):29-34.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).《中國(guó)藥典》(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：242-243.

[4]國(guó)家中醫(yī)藥管理局編委會(huì)：中華本草(下冊(cè))[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998：1620-1625.

[5]鄭尚珍.超臨界二氧化碳法研究石香薷精油化學(xué)成分[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001,37(2):49-52.

[6]曾虹燕.石香薷揮發(fā)油提取的比較研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2003,15(2):135-137.

[7]張良溫.細(xì)葉香薷揮發(fā)油主要成分的研究[J].中草藥，1990,21(3):42-43.

[8]劉靜.石香薷揮發(fā)油抑菌和免疫應(yīng)答作用[J].中南民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，15(4):52-55.

[9]鄭占虎.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用(第四卷)[M].北京：學(xué)苑出版社，1998:3354-3360.

[10]楊彩霞，康淑荷，荊黎田，等.石香薷中的黃酮體化合物[J].西北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，24(1):31-33.

[11]鄭尚珍，孫麗萍，沈序偉.石香薷中化學(xué)成分的研究[J].植物學(xué)報(bào)，1996,38(2):156-160.

[12]Volpi N, Bergonzini G. Analysis of flavonoids from propolis by on-line HPLC-electrospray mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2006,42(3):354-361.

[13]張俊，程衛(wèi)東，史學(xué)偉，等.紫胡蘿卜花青素提取工藝及其體外抗菌活性研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2016,41(11):140-144.

[14]馮貴濤，彭黔榮，楊敏，等.藍(lán)莓花青素提取純化、組成成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2016,41(4):146-152.

[15]劉曉艷，楊國(guó)力，于純淼.功能型復(fù)合食用菌調(diào)味品的工藝開(kāi)發(fā)研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2016,41(1):121-123.

[16]邱松山，陳芳玲，姜翠翠，等.肉桂皮精油提取工藝的優(yōu)化及成分分析[J].中國(guó)調(diào)味品，2015,40(8):111-122.

[17]Benavente-Garacia O,Castillo J. Uses and properties of Citrus flavonoids[J].Agric Food Chem,1997,45:4505-4515.