產(chǎn)氨基甲酸乙酯降解酶酵母菌的選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

姚曉瑞寧，高飛飛，王斌，肖婧，史學(xué)偉*

(1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院， 新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué) 信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate)是一種普遍存在于發(fā)酵食品中的有毒有害物質(zhì)[1，2]。從20世紀(jì)40年代開始，不斷有科學(xué)家證實(shí)了EC的致癌性，許多國家也出臺(tái)了酒精飲料中EC含量的限值。2007 年，IARC(the International Agency for Research on Cancer)經(jīng)評估后提升了EC的危險(xiǎn)等級，將其從2B類致癌物質(zhì)提高為2A類致癌物質(zhì)[3]。幾年來用于降低食品中EC含量的方法主要集中在減少前體物質(zhì)、生產(chǎn)工藝調(diào)節(jié)和添加EC降解酶這幾個(gè)方面，而酶解法無疑是最有效、最直接的途徑。而作為大多數(shù)食品中的主要發(fā)酵劑，酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)酶性能一直是近年來大家關(guān)注的焦點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過大量篩選，發(fā)現(xiàn)了一株可以降解EC的酵母菌，并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，明顯提升了酶活，對EC的降解起到了良好的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

來自新疆石河子周邊團(tuán)場、新疆巴音郭楞蒙古自治州各大葡萄產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨2%、酵母浸粉1%、瓊脂2%，均為美國Sigma公司生產(chǎn)；葡萄糖2%(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，自然pH，115 ℃滅菌30 min。

篩選培養(yǎng)基[4-6]：氯化鈉0.2%、磷酸二氫鉀0.25%、硫酸銨0.4%、氯化錳0.01%、硫酸鋅0.015%，以上試劑均購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，氨基甲酸乙酯0.25%(美國Sigma公司)，pH 5，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%、酵母浸粉1%、葡萄糖2%、氨基甲酸乙酯0.2%，自然pH。

1.1.3 主要試劑

BioFlux DNA試劑盒；BIOWEST瓊脂糖；Trans2K DNA Marker；2×Easy Taq PCR SuperMix；檸檬酸；檸檬酸鈉；氯化銨；硫酸，均購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

分光光度計(jì)、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、血球計(jì)數(shù)板。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離和純化

用20 mL無菌水浸泡洗滌新疆釀酒葡萄，將表皮上的微生物洗入無菌水中，取1 mL洗滌液進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)稀釋梯度涂布3個(gè)平板(YEPD培養(yǎng)基)，28 ℃培養(yǎng)24 h，將平板上不同形態(tài)的菌株單獨(dú)劃線培養(yǎng)，每株菌3個(gè)平行，通過顯微鏡觀察，挑選出具有酵母菌形態(tài)的菌株。接入到篩選培養(yǎng)基中，在以EC為唯一碳源的培養(yǎng)基上能生長的菌株具有能降解EC的能力[7]。

1.2.2 菌株鑒定

吸取1 mL液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入1.5 mL離心管中，14000 r/min離心3 min，棄上清液，沉淀為目的菌株。使用BioFlux DNA試劑盒提取DNA；PCR擴(kuò)增條件為：50 μL反應(yīng)體積，95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性1 min，52 ℃ 退火2 min，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃ 延伸10 min[8]。取3 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，條帶清晰，送上海生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast比對。

1.2.3 EC酶活定義

常溫常壓、中性pH條件下，每1 min分解EC產(chǎn)生1 nmol氨或1 nmol乙醇的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.2.4 粗酶液的制備

將篩選出的菌株接入不加瓊脂的液體篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，離心將菌種分離，用檸檬酸緩沖液(pH 5)洗滌2次，離心沉淀。冰浴超聲破碎，破碎液于4 ℃ 12000 r/min離心5 min，取上清液，即為粗酶液[9]。

1.2.5 酶活測定方法

取2支試管，分別加入200 μL EC溶液，25 ℃水浴加熱40 min，向2支試管中分別加入100 μL粗酶液，向其中一支試管中加入50 μL 0.1 mol/L硫酸使酶失活，作為空白對照，另一支試管放入25 ℃，水浴1.5 h，后同樣加入50 μL 0.1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，按照Berthelot 反應(yīng)顯色法，在波長625 nm下測定吸光值，計(jì)算酶活[10-12]。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用氯化銨配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長625 nm下測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 菌株產(chǎn)酶優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)前，先用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算液體培養(yǎng)基中酵母菌的個(gè)數(shù)，在做每個(gè)因素的實(shí)驗(yàn)前，用無菌水將菌液稀釋至相同的數(shù)量級，減少試驗(yàn)誤差。本文統(tǒng)一為106數(shù)量級。

1.2.7.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

將菌株按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%添加，分別在24，26，28，30，32 ℃，培養(yǎng)7天，測定其產(chǎn)酶能力。

1.2.7.2 初始pH對產(chǎn)酶的影響

將菌株按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%添加，初始pH調(diào)整為4，5，6，7，8，9，10，在28 ℃培養(yǎng)7天，測定其產(chǎn)酶能力。

1.2.7.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

將菌株按發(fā)酵培養(yǎng)基的1%，2%，3%，4%，5%添加，pH 6，28 ℃培養(yǎng)7天，測定其產(chǎn)酶能力。

1.2.8 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.8.1 pH對酶活性的影響

分別配制pH為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的緩沖液，加入粗酶液，測定酶的最適反應(yīng)pH。

1.2.8.2 溫度對酶活的影響

將粗酶液置于25，30，35，40，45 ℃下，分別測定酶活。

1.2.8.3 熱穩(wěn)定性研究

將粗酶液置于30，40，50 ℃下保溫100 min，間隔20 min測1次酶活。

1.2.8.4 金屬離子對酶活性的影響

將粗酶液中加入1 mmol/L的不同種金屬離子(Cu2+，F(xiàn)e2+，Ca2+，Mn2+)，35 ℃放置12 h，測定酶活，去離子水做空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

從葡萄表皮共分離出120株菌，其中按照形態(tài)學(xué)挑選出50株酵母菌[13]，經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選出1株生長良好的菌株，見圖1。

圖1 酵母菌形態(tài) Fig.1 Morphology of yeast

2.2 菌株鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶大約在500 bp左右，ITS核酸序列測序結(jié)果為：GGGTTACTGCTGATTTATATCTTATACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATAATACCATGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGTTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACATTTAGCACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCGGAGGAA；經(jīng)Blast同源性比對，結(jié)果顯示為與PichiafermentansKY076614.1 的ITS核酸序列相似度為97%。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳見圖2。菌株YX22 ITS 基因發(fā)育樹見圖3。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 PCR amplification product agarose gel electrophoresis

圖3 菌株YX22 ITS 基因發(fā)育樹Fig.3 The ITS genetic tree of strain YX22

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

NH4+測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 NH4+測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of NH4+

2.4 菌株產(chǎn)酶優(yōu)化

2.4.1 溫度對產(chǎn)酶的影響

圖5 溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme production

由圖5可知，酵母菌隨著溫度增加產(chǎn)酶能力逐漸增加，在28 ℃時(shí)產(chǎn)酶活力較高，之后隨著溫度增加產(chǎn)酶能力逐漸降低，但在26～30 ℃的范圍內(nèi)，產(chǎn)酶性能均良好。

2.4.2 初始pH對產(chǎn)酶的影響

圖6 pH對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of pH on enzyme production

由圖6可知，在pH 4～10的范圍內(nèi)，菌株產(chǎn)酶能力出現(xiàn)先增后降，在pH 4～7的范圍內(nèi)平穩(wěn)增長，pH>7之后出現(xiàn)明顯下降，證明菌株在pH中性偏酸性時(shí)有良好的產(chǎn)酶能力，優(yōu)勢明顯。

2.4.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

圖7 接種量對酶活的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on enzyme activity

一般來說，接種量越大，積累的酶越多，但是在實(shí)驗(yàn)室封閉培養(yǎng)的條件下，營養(yǎng)物質(zhì)有限，如果接種量過多，會(huì)使得單個(gè)酵母菌細(xì)胞能利用的營養(yǎng)物質(zhì)變少，從而減少產(chǎn)酶量，由圖7可知，接種量在2.5%時(shí)產(chǎn)酶量明顯增加。

2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 最適pH

圖8 pH對酶活的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

由圖8可知，當(dāng)pH由4上升到7時(shí)，酶活力穩(wěn)步增加，高于7時(shí)則大幅下降，說明此酶的耐酸性較好，而堿性環(huán)境會(huì)使其活力降低，原因可能是堿性環(huán)境破壞了酶的正常結(jié)構(gòu)，從而影響了酶的活力；pH在6～7時(shí)，酶活力變化不大，故最適pH為6～7。

2.5.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性

圖9 溫度對酶活的影響Fig.9 Effect of temperature on enzyme activity

由圖9可知，溫度在低于30 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，酶活力增大；溫度高于30 ℃時(shí)，酶活力逐漸降低，在30 ℃時(shí)，酶活力最高。

圖10 熱穩(wěn)定性Fig.10 Thermal stability

由圖10可知，在各個(gè)溫度條件下，酶的活性都相對穩(wěn)定，在30 ℃下保溫100 min后，酶的活力仍保留74%，證明在此溫度下酶的活性有良好的穩(wěn)定性；在40 ℃和50 ℃的條件下，保溫100 min后，酶活力分別剩余59%和44%，說明此酶在高溫條件下不穩(wěn)定，易失活。

2.5.3 金屬離子對蛋白活性的影響

表1 金屬離子對酶活力的影響Table 1 Effect of metal ions on enzyme activity

由表1可知，Cu2+和Fe2+對酶活力有激活作用，而Ca2+和Mn2+均有抑制酶活的作用，其中Fe2+的激活作用最明顯，而Ca2+的抑制作用最明顯。

3 結(jié)論

在葡萄酒釀造過程中，釀酒酵母和細(xì)菌的共同發(fā)酵作用產(chǎn)生了EC，從1971 年，L?froth等[14，15]在葡萄酒、啤酒中發(fā)現(xiàn)了EC，到1976 年，Ough[16]證明了葡萄酒中含有EC，之后陸續(xù)的研究也證明了葡萄酒中EC的致癌性，而EC的前體物質(zhì)眾多，它本身又是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)，所以用生物產(chǎn)酶降解的方法是目前認(rèn)為最可靠的方法；1990 年，F(xiàn)ujinawa S等[17]成功將酸性脲酶應(yīng)用于葡萄酒中，使得酒液中的尿素減少，從而降低EC的含量。本實(shí)驗(yàn)從釀酒酵母表皮上成功分離純化了一株酵母菌，通過ITS序列測定分析后確定為發(fā)酵型畢赤酵母(Pichiafermentans)；酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該酵母菌最適產(chǎn)酶溫度為28 ℃，最適產(chǎn)酶初始pH為7，最適產(chǎn)酶接種量為2.5%；該酵母菌所產(chǎn)酶的最適pH為6～7，最適溫度為30 ℃，并且在此溫度下酶活穩(wěn)定性較好，F(xiàn)e2+對此酶有激活作用，說明金屬離子可以提高該酶的活性。將可以產(chǎn)EC酶的酵母菌作為發(fā)酵劑直接或者混合加入，會(huì)更直接、更有效地降低酒精飲料中EC的含量。

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