基于實時熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測四川工業(yè)泡菜發(fā)酵過程中主要細菌的變化

張亞豪，梁會朋，常聰，尹禮國，張文學

(四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065)

泡菜是深受我國人民喜愛的一種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品，距今已有三千多年的歷史[1]。作為人們?nèi)粘ｏ嬍车囊环N佐餐或配菜，泡菜是一種利用依賴附著在蔬菜表面的微生物或人為添加的發(fā)酵劑，并加入少量食鹽進行發(fā)酵而制成的產(chǎn)品。泡菜中含有多種維生素、益生素、有機酸、礦物質(zhì)和豐富的膳食纖維[2]。近年來研究表明：泡菜不僅是美味可口的小菜，而且還具有許多保健功能，如調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增進食欲，降低血清膽固醇水平和血脂濃度等功效[3]。

前期的研究表明：泡菜中的細菌主要由變形菌門和厚壁菌門構(gòu)成[4]，優(yōu)勢細菌菌屬主要包括乳桿菌屬、鹽單胞菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬[5]。因此，分析泡菜發(fā)酵過程中這些門和屬的生物量變化，對于四川泡菜發(fā)酵工藝的改進、發(fā)酵過程的控制以及產(chǎn)品風味的提高具有重要的指導意義。近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于復雜微生物群落中微生物的定量分析，羅青春等[6]采用qPCR技術(shù)對不同年份窖泥中主要產(chǎn)甲烷菌進行了定量研究，王興興等[7]基于定量PCR方法初步分析了西藏開菲爾粒中細菌與酵母菌的數(shù)量變化。在泡菜微生物研究方面，已有報道采用微生物純培養(yǎng)、克隆文庫和PCR-DGGE等技術(shù)對泡菜發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)進行了解析[8]，但是對于微生物定量數(shù)據(jù)的報道較少。本文采用qPCR技術(shù)對四川泡菜發(fā)酵過程中的變形菌門和厚壁菌門、乳桿菌屬、鹽單胞菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬進行了定量檢測，研究的結(jié)果為泡菜發(fā)酵的機理解析、發(fā)酵工藝過程控制以及四川泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品的采集與保存

青菜泡菜不同發(fā)酵時期的原液樣品取自四川李記醬菜調(diào)味品有限公司(2016年5月)，樣品取回后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要實驗試劑

水樣DNA提取試劑盒(OMEGA)，2×Taq PCR Master Mix(TIANGEN)，SYBR Green Real-time PCR Master Mix(TOYOBO)，DNA片段純化膠回收試劑盒(Sangon)，DH5α-感受態(tài)細胞(TIANGEN)，T-載體PCR克隆試劑盒(Sangon)，普通質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)。

1.1.3 主要實驗儀器

高速冷凍離心機(Thermo Scientific，USA)、超凈工作臺(中國蘇凈)、梯度PCR儀(TECHNE，UK)、電泳儀(北京六一)、凝膠成像儀(Bio-Rad，USA)、微量核酸與蛋白質(zhì)分析儀(GE，USA)、LightCycler Nano實時熒光PCR儀(Roche，Switzerland)。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜樣品DNA的提取

采用基因組DNA 抽提試劑盒提取泡菜樣品中微生物的總DNA，具體步驟詳見說明書，獲得的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標準品制備和標準曲線構(gòu)建

qPCR的定量采用絕對定量法，即采用已知濃度的標準品制作標準曲線，對未知濃度的樣品進行其拷貝數(shù)的測定。從實驗室構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫中挑選乳桿菌屬、假單胞菌屬、鹽單胞菌屬和弧菌屬的克隆子，在含有氨芐的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒。標準品為含有目的片段的單拷貝克隆質(zhì)粒，其濃度的計算如下[9]：

qPCR反應所使用的引物(上海生工生物有限公司合成)及其相關(guān)信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR分析的特異性引物Table 1 Group-specific primer sets for real-time quantitative fluorescence PCR analysis

將標準品進行10倍梯度稀釋，利用表1中的特異性引物與其相對應的標準稀釋液模板進行qPCR反應，反應體系見表2。

表2 實時熒光定量PCR反應的擴增體系Table 2 Amplification system for real-time quantitative fluorescence PCR reaction

反應程序：95 ℃保持10 min，95 ℃變性15 s，最佳退火溫度(見表1)退火30 s，72 ℃延伸15 s。每個熒光定量PCR反應重復2次，共進行45個循環(huán)。反應結(jié)束后，以標準品濃度的對數(shù)作為橫坐標，閾值循環(huán)數(shù)Cq作為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 泡菜樣品中細菌含量的qPCR分析

將待測樣品DNA按與制備標準曲線相同的反應體系和反應條件進行qPCR特異性擴增，每次實驗都設陰性對照和標準品校正，每個樣品做2個平行，以保證實驗數(shù)據(jù)的有效性和可重復性，并根據(jù)標準曲線計算泡菜發(fā)酵液中各類細菌的拷貝數(shù)。且在擴增結(jié)束后進行熔解曲線分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR反應的標準曲線及熔解曲線

本實驗中各類細菌的qPCR擴增曲線基線平整，指數(shù)區(qū)明顯且陡度大，平合區(qū)能夠匯于一起，為典型的倒S曲線，且線性范圍較寬。各類細菌用于定量的標準曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及擴增效率見表3。

表3 實時熒光定量PCR反應標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)、斜率和擴增效率Table 3 Correlation coefficients, slopes and efficiencies of standard curves constructed by real-time quantitative fluorescence PCR using species-specific primers

由表3可知，厚壁菌門、變形菌門和乳桿菌屬、鹽單胞菌屬、假單胞菌屬及弧菌屬熒光定量PCR標準曲線的回歸方程相關(guān)系數(shù)均>0.99，其擴增效率均達到90%以上。說明其熒光定量PCR達到了良好的擴增效果。

qPCR的熔解曲線見圖1。

圖1 泡菜樣品中細菌qPCR檢測的熔解曲線圖Fig.1 Melting curves of qPCR for the bacteria in pickle samples

由圖1可知，實驗中所有反應的熔解曲線表現(xiàn)為單一熔解峰，說明無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，曲線平穩(wěn)，說明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴增引物特異性較好。

2.2 泡菜發(fā)酵過程中細菌數(shù)量的動態(tài)變化

取發(fā)酵1, 3, 5, 13, 26, 41, 68, 81, 103天的泡菜液作為研究對象，泡菜發(fā)酵過程中各類細菌數(shù)量的變化見圖2。

圖2 泡菜發(fā)酵過程中微生物動態(tài)變化曲線圖Fig.2 Dynamic curves of the microorganism during the pickle fermentation process

發(fā)酵初期，厚壁菌門和變形菌門的數(shù)量快速增加，之后二者的數(shù)量在一定程度的下降后又增加；發(fā)酵中期，厚壁菌門的數(shù)量超過變形菌門；發(fā)酵后期，厚壁菌門的數(shù)量穩(wěn)定在1010Copies/mL，變形菌門的數(shù)量穩(wěn)定在109Copies/mL。

在屬水平上，乳桿菌屬的含量在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出明顯的增加，其生物量由最初的8.17×107Copies/mL增加到后期的1.68×1011Copies/mL。鹽單胞菌屬和弧菌屬的含量除在發(fā)酵的前5天有小幅上升，在之后的發(fā)酵過程中分別維持穩(wěn)定在108，109Copies/mL。假單胞菌屬的含量除最開始的5天，在整個發(fā)酵過程中表現(xiàn)出遞減的趨勢，其生物量由發(fā)酵初期的4.01×1011Copies/mL減少到后期的1.77×109Copies/mL。

由實驗結(jié)果可知，在泡菜的整個發(fā)酵過程中，前期優(yōu)勢菌門為變形菌門，中期和后期是厚壁菌門。乳桿菌屬作為發(fā)酵泡菜中常見的乳酸菌，在整個發(fā)酵過程中明顯增加，主導著整個泡菜的發(fā)酵過程，它能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸，使泡菜中乳酸含量快速增加，pH值降低并且抑制其他微生物生長，發(fā)酵3天后細菌含量的下降，可能是由于酸性環(huán)境的抑制作用所致；同時，之前的研究也表明乳桿菌屬具有降低亞硝酸鹽含量和生成泡菜特有風味物質(zhì)的能力[16]。鹽單胞菌屬具有一定的耐鹽和分解利用葡萄糖的能力[17]，這解釋其在泡菜中存在的合理性，與之前文獻報道泡菜中檢測到鹽單胞菌屬相符。假單胞菌屬具有強的適應能力，被報道在植物中廣泛存在，其中一些菌種對植物有益可作為保護菌株使用，某些菌株可以產(chǎn)酶促進蛋白質(zhì)和脂肪的水解，也能產(chǎn)果膠酶加速降解植物細胞壁[18,19]，故推測其對泡菜風味物質(zhì)的形成有一定的貢獻，需要注意的是，也有報道一些蔬菜中存在的假單胞菌屬的某些菌株是病原菌，對農(nóng)業(yè)和生態(tài)有害[20]。弧菌屬通常在海產(chǎn)品、腌肉和鹽漬食品中有較高的檢出率[21]，泡菜作為一種鹽漬發(fā)酵食品，在發(fā)酵過程中檢測到一定量的弧菌屬于正常情況，弧菌作為一種條件致病菌，易危害食品安全和引起人類腹瀉，因此，對泡菜中弧菌屬組成的進一步研究有著重要意義。

3 結(jié)論

四川工業(yè)泡菜中微生物種類豐富，采用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)和常規(guī)分離技術(shù)難以對其中的微生物進行準確定量，實時熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度高和速度快等特點，特別是可以準確地計算出樣品中起始基因的拷貝數(shù)，同時也避免了PCR-DGGE等分析普通PCR產(chǎn)物所帶來的誤差，可為泡菜中微生物的定量提供快速準確的定量方法。

本研究首次利用熒光定量PCR技術(shù)對泡菜發(fā)酵過程中的主要細菌進行了定量檢測，結(jié)果表明：在門水平上，泡菜發(fā)酵的前期，變形菌門在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢；發(fā)酵的中期和后期，厚壁菌門的含量超過變形菌門成為優(yōu)勢菌門，一直持續(xù)到整個發(fā)酵過程的結(jié)束。在屬水平上，乳桿菌屬的含量隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢，是發(fā)酵過程中的絕對優(yōu)勢菌；假單胞菌屬的含量隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)遞減的趨勢；鹽單胞菌屬和弧菌屬的含量在整個發(fā)酵階段均只出現(xiàn)小幅波動，基本維持穩(wěn)定。實時熒光定量PCR技術(shù)能快速準確地監(jiān)測泡菜發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化，本實驗結(jié)果揭示了四川工業(yè)泡菜發(fā)酵過程中主要細菌的數(shù)量變化趨勢，可為其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎。

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