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    人參化感作用及其研究進展

    2018-01-23 15:58:00陳長寶張瑞王恩鵬許永華王英平
    特產(chǎn)研究 2018年1期
    關(guān)鍵詞:化感人參物質(zhì)

    陳長寶,張瑞,王恩鵬,許永華,王英平,3※

    (1.長春中醫(yī)藥大學,長春 130117;2.吉林農(nóng)業(yè)大學,長春 130122;3.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所,長春 130112)

    人參(PanaxginsengC.A.Mey.)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載,認為人參有“補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心益智”的功效,“久服輕身延年”;《本草綱目》對人參極為推崇,認為它能“治男婦一切虛癥”。同時人參也是我國出口額最大的中藥材品種,2016年人參及飲片出口額達到1.47億美元,同比增加26%[1]。2012年衛(wèi)生部批準5年及以下人工種植的人參為“新資源食品”[2],極大地促進了人參消費,推動了人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2016年吉林省人參產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值達到505億,人參種植成為吉林省長白山地區(qū)農(nóng)民收入的重要來源之一。

    參農(nóng)在長期的生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn),人參種植存在連作障礙,栽過一茬人參的土壤要30年后才能再次栽參。已有的研究認為,人參連作障礙是由于栽參土壤理化性質(zhì)變劣[3~5]、病原微生物累積所致[6],但改良土壤和徹底滅菌并不能解決人參連作障礙問題,因此,本課題組提出了“化感物質(zhì)-土壤劣變-病原微生物”的相互作用是連作障礙主要原因的新觀點,從化感作用的角度開展人參連作障礙研究[7]。

    化感作用是指植物或微生物的代謝分泌物對環(huán)境中其他植物或微生物的有利或不利的作用[8],早在2000多年前就已經(jīng)有了化感作用的描述。近年來,隨著科學技術(shù)的進步和精密分析儀器的不斷出現(xiàn),人參領(lǐng)域的研究學者對化感作用的研究逐步活躍起來,從不同學科的角度入手,開展人參化感作用研究,并取得較大進展。本文就人參領(lǐng)域化感作用研究成果作綜述,以期為其進一步的研究提供參考。

    1 人參化感作用

    人參化感作用主要是自毒作用[9],具體表現(xiàn)為對種子萌發(fā)、愈傷組織生長、根系組織活力、幼苗生長、根系酶活性等方面的抑制作用和對根尖組織結(jié)構(gòu)的影響[7,9~13],在生產(chǎn)上表現(xiàn)為保苗率低、病害嚴重,嚴重影響人參的產(chǎn)量和質(zhì)量。

    2 人參化感作用研究方法

    選擇適宜的實驗方法,對于準確快速鑒別化感物質(zhì)、研究化感物質(zhì)活性及作用機理、探討化感作用解除方法,具有十分重要的意義。

    2.1 培養(yǎng)皿法

    培養(yǎng)皿底部鋪2層滅菌濾紙,加入供試液,種子或幼苗置于濾紙上,培養(yǎng)箱中避光保濕培養(yǎng)[12]。培養(yǎng)皿法具有快速、直觀、成本低等優(yōu)點,可以排除土壤成分、微生物等干擾,同時不受季節(jié)和氣候的影響,是目前人參化感作用研究中最常用的獲取生物樣品的方法。

    2.2 愈傷組織培養(yǎng)法

    基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、蔗糖3%、瓊脂0.7%。在基本培養(yǎng)基種添加不同濃度的萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、芐氨基腺嘌呤(BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等植物生長激素,用于愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH6.0。高溫濕熱滅菌(121℃,20min)冷卻后接種。人參樣品用 0.1%升汞進行表面消毒8min~10min,無菌水沖洗3~4次,將樣品切成小段,在無菌條件下接種,進行人參愈傷組織誘導(dǎo)、培養(yǎng)[10]。愈傷組織培養(yǎng)法可以大量、快速獲得具有相同基因的樣品,可以有效去除由于遺傳背景不同帶來的干擾。

    2.3 水培法和砂培法

    選擇適宜的培養(yǎng)器皿,用蒸餾水或石英砂代替土壤,添加營養(yǎng)液,利用自然光或人工補光,培養(yǎng)人參植株。該方法適宜培養(yǎng)較大人參植株,可以測定化感物質(zhì)對植株生長量、植株形態(tài)等方面的影響;另外,可以收集培養(yǎng)液,分析根系分泌物和次生代謝產(chǎn)物[14,15]。

    2.4 田間試驗法

    人參化感作用田間試驗主要分為老參地研究和新土地添加研究。老參地研究是在老參地土壤中播種、移栽人參,分析老參地土壤對人參生長發(fā)育的影響[10];或者分析老參地土壤中有機物成分,探索化感物質(zhì)的種類。新土地添加研究是將供試樣品加入未栽培人參的土壤中,播種、移栽人參,分析供試樣品對人參生長發(fā)育的影響。田間試驗影響因素較多,不易成功,但可以真實模擬田間的生態(tài)環(huán)境[16],最大限度地接近生產(chǎn)實際狀況,研究成果能快速轉(zhuǎn)化為實際生產(chǎn)力。

    此外,其他植物的化感作用研究中還經(jīng)常用到階梯栽培法、根滲出液循環(huán)栽培法、植物盒法、試管苗法等[17],這些方法在人參化感作用研究中,也可根據(jù)不同的實驗?zāi)康?、實驗材料來加以選擇性借鑒。

    3 人參化感物質(zhì)研究

    根據(jù)孔垂華[18]對化感作用的基本特征的描述,人參化感物質(zhì)的特征可以總結(jié)為相互作用的主客體均是人參;相互作用的化學物質(zhì)是人參的次生代謝物質(zhì),而且必須有適合的途徑進入環(huán)境中,不包含在人參體內(nèi)變化的次生代謝物質(zhì);化感物質(zhì)主要用于影響自身的生長發(fā)育。人參化感物質(zhì)是人參化感作用研究的熱點之一。

    3.1 化感物質(zhì)來源

    研究結(jié)果表明,人參化感物質(zhì)主要來源于根系分泌物(次生代謝產(chǎn)物)[10]和根、落葉、殘體的腐解物這兩種物質(zhì)。在植株的生長過程中,根系分泌物與根、落葉、殘體的腐解物等物質(zhì)分布在植株附近土壤中[19],其中,水溶成分濃度隨著雨水淋溶時間推移而降低,非水溶成分(特別是小分子、弱極性物質(zhì))在根部土壤中逐漸積累,當達到一定濃度后,對植株本身產(chǎn)生毒害作用,表現(xiàn)為化感自毒。

    3.2 化感物質(zhì)種類

    Rice[20]把高等植物中的化感物質(zhì)分為簡單的水溶性有機酸、直鏈醇、脂肪醇、脂肪醛和酮;脂肪酸和聚乙炔;簡單的酚、苯甲酸及其衍生物;肉桂酸及其衍生物;香豆素類;單寧;萜類和甾族化合物;氨基酸和多肽;生物堿和氰醇;簡單的不飽和內(nèi)酯;醌類;黃酮類;糖苷硫氰酸酯;嘌呤和核苷以及其他化合物等15類,其中酚類和萜類是高等植物的主要化感物。

    陳長寶等[21]對根際土壤有抑制活性的組分進行了物質(zhì)組成分析與分子結(jié)構(gòu)鑒定,初步確定人參部分化感物質(zhì)組成成分為棕櫚酸甲酯等酯類、9,12-十八(烷)酸、(Z,Z)-十五(烷)基酸等酸類、雙環(huán)(10,8,0)二十烷、(Z)、二十三烷、5,6-四亞甲基四氫-1,3-嗪-2-硫-4-環(huán)己烷、二十五烷等55種物質(zhì),其中有機酸類是主要的化感物質(zhì)。這一研究結(jié)果得到多位學者相關(guān)研究的支持[22~26]。

    3.3 化感物質(zhì)提取、分離、檢測方法

    早期對化感作用的研究主要集中在對現(xiàn)象的描述、對有益化感作用的利用、對有害化感作用的解除等宏觀方面,隨著將植物化學學科的理論和技術(shù)應(yīng)用于化感研究,相關(guān)研究進入到對化感物質(zhì)的探尋階段。有關(guān)人參化感物質(zhì)提取方法的研究報道,主要有超聲法、回流法、滲漉法、浸提法、腐解法等方法[17],在其他高等植物的化感作用研究中也有采用夾層法、常溫吸附法等方法[27]。提取溶劑包括水、甲醇、乙醚等,根據(jù)化感物質(zhì)的極性來篩選,通常采用兩種或多種不同極性的試劑對同一樣品分別提取的方法,將樣品中的化感物質(zhì)進行充分提取。化感物質(zhì)的分離、純化方法根據(jù)其理化特性進行選擇,主要包括萃取法、層析法、離子交換樹脂法、大孔樹脂法、聚酰胺凝膠法、重結(jié)晶法等。對于大多數(shù)化感物質(zhì)可以采用質(zhì)譜+已知化合物數(shù)據(jù)庫的方法進行鑒定,對于分離得到的新化合物可采用質(zhì)譜、核磁共振、紅外光譜、X晶體衍射等技術(shù)確定其分子式和化學結(jié)構(gòu)[14,21,28]。

    陳長寶等[21]采集栽參土壤用蒸餾水超聲提取濃縮后通過XAD-4大孔吸附樹脂柱,依次用水、20%甲醇和90%甲醇洗脫,收集各洗脫液并濃縮得人參根際土壤提取物,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對分離得到的樣品進行成分鑒別分析。RobertWNicol等[28]報道,通過利用Tang&Young設(shè)計的根系分泌物收集系統(tǒng),從西洋參根際土壤中收集根系分泌物,經(jīng)過高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)法分析確定這些根系分泌物中含有皂苷成分。王玉萍等[14]采用全營養(yǎng)水培方法培養(yǎng)西洋參,每3天更換1次營養(yǎng)液,將更換下來的培養(yǎng)液通過預(yù)先處理好的XAD-4樹脂柱,以吸附其中的疏水性物質(zhì),而后用200mL甲醇洗脫,得淡黃色洗脫液;將洗脫液在50℃水浴中減壓蒸干,得到褐色的西洋參疏水性根系分泌物,采用GC-MS聯(lián)用方法對此疏水性根系分泌物的化學成分進行分析和鑒定。

    4 人參化感作用機理

    在高等植物中,化感作用機理主要可以總結(jié)為6個方面[29]:1)影響抗氧化酶系統(tǒng)及細胞膜透性[30,31];2)影響水分和營養(yǎng)物質(zhì)吸收[32,33];3)影響植物中的激素[33];4)影響細胞分裂、伸長以及亞顯微結(jié)構(gòu)[34];5)影響光合作用和呼吸作用[35~37];6)影響基因表達和蛋白質(zhì)的合成[38,39]。李麗等[40]將西洋參化感自毒作用發(fā)生機制總結(jié)為6個方面:1)對細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的影響;2)對激素的影響;3)對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的影響;4)對呼吸作用和光合作用的影響;5)對酶活性的影響;6)對相關(guān)基因表達的影響。

    5 人參化感作用種質(zhì)資源評價研究

    目前,對于化感作用種質(zhì)資源研究主要集中在水稻、小麥、番茄等作物以及蔬菜大宗品種上。朱紅蓮等[41]建立了土培、砂培、特征性次生物質(zhì)標記和田間試驗等4種化感潛力評價方法,并利用這4種評價方法對225份中國水稻種質(zhì)資源進行了化感潛力評價。許勇[42]應(yīng)用浸提法、蛭石共培法、盆栽法和田間鑒定法研究了小麥對不同雜草的抑草化感力,并選擇出了對牛繁縷抑制力高的10-28、N57小麥品系和抑制力低的10-174、K品系;對看麥娘抑制力高的N74品系和抑制力低的10-54、N260、N362品系。耿廣東等[43]以萵苣為受體材料研究了番茄不同品種間化感作用的差異,結(jié)果表明,番茄不同品種間化感作用的差異較為明顯,并通過綜合隸屬函數(shù)值評價了品種間的化感作用大小,最后對不同番茄品種進行Q型聚類分析,分析的結(jié)果與綜合隸屬函數(shù)值得出的結(jié)果一致。

    新品種“中農(nóng)皇封參”在老參地(二茬土、三茬土)品比試驗中,表現(xiàn)出較強的抗連作特性,與對照品種相比,保苗率、抗病性均有顯著性差異[44]。其它有關(guān)人參化感作用種質(zhì)資源、品種選育方面的研究報道較少。

    6 存在的問題和研究展望

    我國人參種植的傳統(tǒng)模式是“伐林栽參”,連續(xù)轉(zhuǎn)場對森林和生態(tài)環(huán)境破壞嚴重。隨著人們對生態(tài)保護的日益重視和“天保工程”的實施,該模式受到限制,多地已禁止“伐林栽參”,人參種植模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤傲窒路律o育”和“農(nóng)田栽參”兩種模式。人參“林下仿生護育”對生態(tài)無破壞,但人參生長年限長,一般需達到15年才能做貨;保苗率低,單根重較小,總體產(chǎn)量低,不能滿足常規(guī)食用市場需求,適宜生產(chǎn)高檔人參。“農(nóng)田栽參”模式已成熟,人參產(chǎn)量和質(zhì)量均有較大幅度的提高,已接近“伐林栽參”的水平?!稗r(nóng)田栽參”除了具有生態(tài)保護方面的優(yōu)勢外,還具有生產(chǎn)場地交通便利,適宜機械化、規(guī)模化、標準化生產(chǎn)的特點,有利于降低日益升高的人工成本、保障原料穩(wěn)定供應(yīng)和保證產(chǎn)品質(zhì)量良好,因此“農(nóng)田栽參”是今后人參種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點方向。

    我國農(nóng)田面積廣闊,但人參道地產(chǎn)區(qū)“宜參農(nóng)田”數(shù)量有限,“農(nóng)田栽參”同樣面臨連作障礙,如何高效利用有限土地資源,降低由于生產(chǎn)轉(zhuǎn)場帶來的成本壓力,實現(xiàn)人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,是我國人參科研人員面臨的重大科技命題。

    隨著施肥、植保、控水調(diào)光等技術(shù)的提高和新肥料、新棚膜等投入品的更新?lián)Q代,進一步凸顯了化感作用在“農(nóng)田栽參”連作障礙影響因素中的地位。對于如何破除人參在“農(nóng)田栽參”模式下化感自毒作用,作者認為首先要加強人參化感作用機理方面的研究,重點突破化感物質(zhì)運輸途徑和作用靶點?,F(xiàn)有人參化感作用研究重點集中在化感物質(zhì)分析、化感作用表現(xiàn)等方面,人參化感作用機理、特別是自毒作用機理研究較少,致使人參化感作用破除技術(shù)研究缺乏基礎(chǔ)理論指導(dǎo),進展緩慢,取得的成效不足以支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展。采用生物化學、分子生物學的理論和技術(shù),結(jié)合人參生理學研究,探明化感物質(zhì)運輸途徑和作用靶點,從阻斷運輸和靶點結(jié)合競爭等方面考慮人參化感作用的破除。其次要開展具有抗化感作用人參種質(zhì)資源篩選,選育具有抗化感作用的人參新品種。具有特殊生理表現(xiàn)型的人參新品種的選育是解決生產(chǎn)難題的根本途徑,借鑒水稻、小麥、番茄等作物研究經(jīng)驗,利用我國人參種質(zhì)資源變異類型豐富多樣、野生資源相對較多的優(yōu)勢,開展人參種質(zhì)資源的化感潛力評價,選育抗化感品種,將資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)業(yè)優(yōu)勢,對于解決人參化感自毒問題,實現(xiàn)人參連作具有事半功倍的作用。

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