轉(zhuǎn)基因及基因編輯技術(shù)與豬遺傳育種

李嘉楠，顧 浩，徐在言，左 波

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

1 轉(zhuǎn)基因與基因編輯技術(shù)概述

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是指使用顯微注射或精子介導(dǎo)等相關(guān)分子生物學(xué)方法將外源基因?qū)氲絼?dòng)物的早期胚胎細(xì)胞中，使外源基因能夠在受體細(xì)胞的基因組中穩(wěn)定表達(dá)，并培育出可遺傳的動(dòng)物個(gè)體或品系。與傳統(tǒng)的育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅克服了物種間固有的生殖隔離，而且實(shí)現(xiàn)了物種間遺傳物質(zhì)的交換。然而在動(dòng)物育種中，許多優(yōu)良性狀的產(chǎn)生并不需要依賴外源基因的導(dǎo)入，僅僅改變自身基因的表達(dá)就能獲得，這種方式被稱為基因編輯技術(shù)。新型動(dòng)物基因編輯技術(shù)是指通過人工核酸酶對(duì)動(dòng)物特定的內(nèi)源性基因進(jìn)行目地性的修飾，如敲除、敲入、定點(diǎn)突變等，并結(jié)合體細(xì)胞核移植與胚胎移植等技術(shù)手段，獲得被修飾編碼的個(gè)體。在基因編輯中，人工核酸酶作為操作基因的“剪刀”，可精確定位到需要編輯的DNA雙鏈，造成目的基因DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand-breaks，DSBs）；同時(shí)，DNA的（非）同源重組修復(fù)可作為“縫針”對(duì)斷裂的DNA雙鏈進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因的敲除和敲入。而隨著人工核酸酶技術(shù)的不斷發(fā)展，基因編輯技術(shù)共經(jīng)歷了三代，即鋅指核酸 內(nèi) 切 酶（zinc finger endonucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸 內(nèi) 切 酶（transcription activatorlike effector endonucleases，TALENs）和 CRISPR/Cas9 [clustered regulatory interspaced short palindromic repeats /Cas（CRISPR associated 9）]技術(shù)。

鋅指核酸內(nèi)切酶是第一代人工核酸內(nèi)切酶，它是由鋅指蛋白和核酸酶FokⅠ組成可以結(jié)合DNA的嵌合蛋白。研究者按照1個(gè)鋅指可以識(shí)別3個(gè)堿基的識(shí)別規(guī)律來設(shè)計(jì)相應(yīng)的鋅指蛋白，對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性識(shí)別。自2002年，首次在果蠅中應(yīng)用成功后，Whyte等用ZFNs技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合生產(chǎn)出eGFP轉(zhuǎn)基因豬，證明了ZFNs技術(shù)可以對(duì)體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞進(jìn)行修飾。第二代人工核酸內(nèi)切酶——類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶TALENs，其蛋白結(jié)構(gòu)大小和鋅指蛋白一樣，除了TALENs的DNA結(jié)構(gòu)域僅識(shí)別一種堿基之外，其他的作用機(jī)制與ZFNs完全一致，這就大大加快了組裝識(shí)別任何靶基因的TALENs。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第三代基因編輯工具，是由Ishino等于1987年在K12大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，是廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)的一種獲得性免疫系統(tǒng)[6]。改造后的Cas9系統(tǒng)主要由向?qū)NA和Cas9蛋白組成，向?qū)NA由一段20 bp大小的識(shí)別序列和一段可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列組成。識(shí)別序列通過堿基互補(bǔ)，靶向到基因組相應(yīng)的位置，重復(fù)序列與Cas蛋白形成復(fù)合體并發(fā)揮酶切作用，切斷目標(biāo)區(qū)域的雙核苷酸鏈。2013年，F(xiàn)eng Zhang等首次利用這一原理應(yīng)用到真核細(xì)胞中，正式將其開發(fā)為基因組編輯新技術(shù)[7]。與前兩代人工核酸酶系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)潔高效，稱得上是21世紀(jì)重要的生物技術(shù)突破，為基因編輯技術(shù)提供了一個(gè)新的平臺(tái)。自從2013年第1頭使用CRISPR/Cas9基因敲除豬誕生后，目前利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行功能基因篩選、抗病育種等研究在豬遺傳育種的應(yīng)用上均已實(shí)現(xiàn)。

2 基因編輯技術(shù)在豬遺傳育種中的應(yīng)用

2.1 提高豬只抗病能力

豬繁殖與呼吸綜合征（也稱豬藍(lán)耳病，PRRS）是一種由PRRS病毒引起的繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的傳染病，可導(dǎo)致母豬妊娠后期流產(chǎn)，仔豬呼吸系統(tǒng)疾病和大量死亡。同時(shí)由于豬藍(lán)耳病病毒的極高突變率和致病性，用疫苗難以進(jìn)行防治，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)。研究表明清道夫受體CD163是豬藍(lán)耳病病毒入侵細(xì)胞時(shí)的重要識(shí)別蛋白。2017年，Chrisine Burkard等 的研究團(tuán)隊(duì)使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除豬CD163基因之后，進(jìn)行侵毒試驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因敲除豬對(duì)PRRSV具有顯著抗病性。豬圓環(huán)病毒病是由圓環(huán)病 毒 2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）引起的多種疾病，可導(dǎo)致母豬繁殖障礙和斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等，嚴(yán)重影響著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)該病毒是通過上調(diào)豬體內(nèi)p53基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)感染宿主細(xì)胞，導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡。Xu等利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了P53基因敲除的PK15細(xì)胞系，來研究PCV2感染后p53基因所發(fā)揮的調(diào)控作用，為獲得抗豬圓環(huán)病毒病奠定了基礎(chǔ)。目前，利用基因編輯技術(shù)獲得的抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因豬和抗小豬腹瀉轉(zhuǎn)人溶菌酶基因豬等抗病豬的產(chǎn)生，為我們防治豬病提供了另一條途徑。通過改變以往的藥物防治，從遺傳本質(zhì)上提高豬對(duì)疾病病原的免疫力，減少抗生素的使用，做到防重于治、養(yǎng)重于防，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展以及人類健康都具有深遠(yuǎn)意義。

2.2 提高生產(chǎn)性能

我國作為養(yǎng)豬大國，養(yǎng)豬不僅能夠?yàn)檗r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來迅猛發(fā)展，而且豬肉作為人類生活肉類食品的重要來源，優(yōu)質(zhì)豬新品種的培育成為研究者的重中之重。1985年，Hammer 等的研究團(tuán)隊(duì)將人的生長(zhǎng)激素注射進(jìn)豬的受精卵中，獲得的轉(zhuǎn)基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬相比，生長(zhǎng)速率、飼料轉(zhuǎn)化率都有明顯提高。隨后中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所合作，將豬的生長(zhǎng)激素基因（growth hormone，GH） 轉(zhuǎn) 入 湖北白豬獲得的轉(zhuǎn)基因豬，其生物轉(zhuǎn)化率比同窩提高10%左右。肌肉生長(zhǎng)抑制素myostatin（MSTN）是繼生長(zhǎng)激素（GH）和胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）的又一新功能基因，對(duì)肌肉生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用，控制豬個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪沉積，是改善豬生長(zhǎng)性能的有效基因。2016年Bi等用CRISPR/Cas9技術(shù)得到了MSTN基因單敲除豬，使肌源性基因表達(dá)量上升，肌纖維數(shù)目的顯著增加表現(xiàn)出特定的“雙肌臀”現(xiàn)象。MSTN主動(dòng)免疫還可以抑制肌酸激酶的活性，控制蛋白表達(dá)，提高個(gè)體瘦肉率。還有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) MSTN 對(duì)脂肪發(fā)育的抑制作用可下調(diào)PPARγ抑制脂肪形成。由MSTN誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞有提高胰島素和葡萄糖的敏感性及氧化能力等特點(diǎn)。因此，MSTN在畜牧生產(chǎn)過程中具有很好的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

2.3 改善豬肉質(zhì)量

不飽和脂肪酸是人體所需的必需脂肪酸，對(duì)人體有很大的好處，可以改善心血管、降低老年癡呆和抑郁癥等。而豬肉中卻含有大量的飽和脂肪酸，食用大量的豬肉會(huì)使人產(chǎn)生高血壓、高膽固醇等疾病，增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。2004年，K．Saeki等人將菠菜根部的FDZA基因轉(zhuǎn)入豬的基因組中，獲得了高不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因豬。2006年，Lai等研究證明秀麗線蟲的FAT-1基因可以使豬肉中ω-6脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?3脂肪酸，通過體細(xì)胞克隆技術(shù)把該基因?qū)胴i的基因組，培育出了富含ω-3脂肪酸的轉(zhuǎn)基因豬。隨后，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所合作也獲得了轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因豬，大大提高了豬肉的營養(yǎng)價(jià)值。過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha， PGC1α），可誘導(dǎo)線粒體的生物合成和細(xì)胞呼吸功能，調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化，改善豬肉品質(zhì)性狀，2017年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)通過轉(zhuǎn)基因豬模型超表達(dá)PGC1α基因，證實(shí)了肌纖維類型的轉(zhuǎn)變，由酵解型肌纖維轉(zhuǎn)化為氧化型肌纖維，為后續(xù)的肉質(zhì)改良工作打下基礎(chǔ)。

2.4 降低環(huán)境污染

近年來，伴隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化程度的不斷提高，養(yǎng)殖場(chǎng)排出的糞便也日益增加，其環(huán)境污染問題也日益突出。由于養(yǎng)殖戶環(huán)保意識(shí)不強(qiáng)、糞便處理能力差，導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)的排泄物是繼工業(yè)三廢后的又一大污染源。植酸即肌醇六磷酸，作為磷酸的儲(chǔ)存庫，通常存在于植物中。飼料中富含的植酸未能被豬完全利用，不僅降低了氮磷利用率，也是糞便中氮、磷排放的主要來源。植酸酶（phytase）能有效分解植酸，催化肌醇六磷酸脫掉磷酸基團(tuán)，早在19世紀(jì)初就引起了人們的注意。2001年，加拿大研究人員通過將大腸桿菌的phytase基因轉(zhuǎn)移到豬上，培育出可在唾液中分泌植酸酶的轉(zhuǎn)基因豬，不僅提高了豬對(duì)飼料中磷的利用率，也使豬糞中的磷含量出現(xiàn)顯著下降，且相對(duì)照于在飼料中添加植酸酶的豬其磷排放量也出現(xiàn)明顯降低。隨后，轉(zhuǎn)葡聚糖酶、轉(zhuǎn)木聚糖酶及轉(zhuǎn)真菌纖維素酶等轉(zhuǎn)基因豬的相繼出現(xiàn)，使得豬對(duì)于飼料中蛋白、纖維素、有機(jī)磷等營養(yǎng)物質(zhì)的利用率顯著提高，進(jìn)而顯著減少磷、氮排放。最近，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳珍芳團(tuán)隊(duì)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)將4種微生物的酶類基因轉(zhuǎn)入豬的基因組中，獲得了無污染、高品質(zhì)、快生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因克隆豬。這4種酶類微生物只在豬的唾液腺中特異性分泌，伴隨飼料進(jìn)入消化道，持續(xù)降解飼料中的有機(jī)磷，顯著提高了氮、磷、鈣等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)與普通豬相比，糞便中氮、磷的排放下降了20%。

2.5 異體器官移植

人的器官移植供體資源短缺，最好的解決辦法就是異體器官移植。目前，豬在器官大小、生理、組織解剖上與人類相似，被認(rèn)為是最佳異體器官移植的首選動(dòng)物。異體器官移植的障礙往往在于細(xì)胞間的免疫排斥和豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。1995年，Cozzi等將人的補(bǔ)體抑制因子和衰退加速因子共轉(zhuǎn)到豬的胚胎中，獲得的轉(zhuǎn)基因豬在器官移植中未出現(xiàn)超敏排斥反應(yīng)。2001年，研究人員通過對(duì)豬器官的細(xì)胞免疫抗原因子α-1，3半乳糖酶進(jìn)行敲除，將獲得的轉(zhuǎn)基因豬器官移植給非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，數(shù)月后同樣未出現(xiàn)免疫排斥現(xiàn)象。2005年，Miyagawa等使用RNAi技術(shù)來抑制豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)，結(jié)果顯示，RNAi可以抑制豬逆轉(zhuǎn)錄病毒在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，為生產(chǎn)抗豬逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)基因豬提供了一個(gè)新方法。2015年，美國印第安納醫(yī)學(xué)院等培育了唾液酸糖蛋白受體基因敲除豬，減少在器官移植過程中血小板減少癥的發(fā)生。人血栓調(diào)節(jié)蛋白（hTM）可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)，具有抗凝作用，清除體內(nèi)凝血酶，目前，已經(jīng)有研究團(tuán)隊(duì)成功獲得可特異性表達(dá)hTM轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因克隆豬，為解決異體器官移植后凝血紊亂提供理論資料。

2.6 動(dòng)物疾病模型

合適的動(dòng)物模型可以推動(dòng)醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，和嚙齒類的大、小鼠等相比，豬、羊等大動(dòng)物與人類在基因組上有較高的同源性，且在體型、生理代謝、疾病特征上的優(yōu)勢(shì)更適合用作動(dòng)物模型、人類疾病和生物制藥等研究。2010年，Yang等使用亨廷頓蛋白轉(zhuǎn)基因載體，成功獲得6頭亨廷頓舞蹈癥轉(zhuǎn)基因豬，該成果對(duì)于亨廷頓舞蹈癥病理發(fā)生機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。Lp-PLA2基因可調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化，2013年，紀(jì)元等獲得了Lp-PLA2基因的豬成纖維細(xì)胞系，為開發(fā)治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物提供新的模型和突破。2015年，北京蛋白質(zhì)組研究中心使用CRISPR/Cas9技術(shù)在豬白蛋白基因區(qū)域插入了人類白蛋白基因，讓豬只產(chǎn)生人血白蛋白，而不產(chǎn)生豬白蛋白。2016年，中國科學(xué)院使用單堿基基因編輯技術(shù)，僅僅只改變一個(gè)堿基，便獲得了只分泌人胰島素的克隆豬，提取的胰島素完全為人胰島素，而不含豬胰島素。因此，使用新型基因編輯技術(shù)尋找疾病早期分子標(biāo)志、闡明相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理、研究新的治療方法、和開發(fā)新藥具有重要意義。

3 展望

隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，不斷成熟，基因編輯和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)品已顯示出了廣闊的應(yīng)用前景和重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；蚓庉嫷墓ぞ咴絹碓骄?xì)化，不僅可對(duì)基因進(jìn)行大片段的刪除或轉(zhuǎn)入，也能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)單個(gè)堿基的改變，基因定點(diǎn)編輯技術(shù)已逐步成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的核心。盡管對(duì)基因的可操縱性越來越強(qiáng)，但是要形成穩(wěn)定安全的新品種（系），并進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化、市場(chǎng)化，還需要與傳統(tǒng)育種技術(shù)結(jié)合，并開展轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全評(píng)價(jià)以及消費(fèi)者的認(rèn)可，目前已有多個(gè)轉(zhuǎn)基因豬新材料正在進(jìn)行農(nóng)業(yè)部安全評(píng)價(jià)，如MSTN基因敲除豬、轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因豬等，相信這些育種新材料將會(huì)給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來新的發(fā)展機(jī)遇。

（參考文獻(xiàn)略）