小鼠腸道菌群對(duì)外周免疫器官影響的研究進(jìn)展①

薛淮娟 馬 龍 秦 歡 姚新生

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫教研室，遵義 563000)

1 腸道菌群的存在方式及作用

腸道菌群作為目前熱門的研究領(lǐng)域之一，在腫瘤的防治與研究、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生與治療、生活規(guī)律的形成影響及抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中，均被證實(shí)具有重要的誘導(dǎo)甚至參與主要的調(diào)控作用[1,2]。根據(jù)菌群對(duì)宿主的影響可大致分為：共生型、致病型、共生致病型。而體內(nèi)如此多樣功能各異的腸道菌群主要是由它們自身產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物，通過直接或間接的方式相互協(xié)調(diào)相互作用，從而增強(qiáng)對(duì)宿主的防御以及提高營養(yǎng)的獲得和保持在炎癥環(huán)境下的持續(xù)存在[3]。但這些微生物很少作為單一的個(gè)體存在于體內(nèi)例如浮游生物的形式，相反它們存在于被統(tǒng)稱為生物膜的區(qū)域內(nèi)，通過自己產(chǎn)生的聚合物基質(zhì)從而避免遭受機(jī)體的免疫攻擊。而每一個(gè)生物膜區(qū)內(nèi)均含有數(shù)百個(gè)不同的微生物，其中具有毒性的細(xì)菌可以保護(hù)生物膜免受外界侵?jǐn)_，而其他物種則主要為生物膜區(qū)獲取相應(yīng)的營養(yǎng)。隨著生物膜區(qū)的形成和不斷發(fā)展，會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)微生物的集體基因表達(dá)發(fā)生顯著變化[4]。其中腸道病毒作為機(jī)體常見的感染源即可通過“跨界相互作用”與腸道微生物相互調(diào)控，并且越來越多的研究認(rèn)為這一調(diào)控方式是導(dǎo)致疾病具有傳染性、誘導(dǎo)性和調(diào)控性的關(guān)鍵點(diǎn)之一,例如小鼠乳腺腫瘤病毒可與革蘭氏陰性菌表面的脂多糖結(jié)合，從而激活了宿主的先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)小鼠乳腺腫瘤病毒的復(fù)制和傳播均表現(xiàn)為高度的耐受性[5]。而作為共生致病型微生物代表的大腸桿菌其可通過獲取新基因，或通過丟失基因的方式改變目前的基因組從而改變自身功能機(jī)制并產(chǎn)生致病性的演變，從而以共生型和治病型兩種不同形式存在于體內(nèi)[4]。而腸道中具有重要調(diào)節(jié)作用的共生菌，其與機(jī)體相互依賴協(xié)調(diào)發(fā)展的基礎(chǔ)，主要來源于宿主細(xì)胞和組織對(duì)共生菌所產(chǎn)生的免疫刺激途徑的耐受能力，例如共生菌所攜帶的LPS可通過激活Toll樣受體4途徑，而Hennezel團(tuán)隊(duì)[6]發(fā)現(xiàn)機(jī)體腸道免疫系統(tǒng)對(duì)LPS所介導(dǎo)的TLR4信號(hào)保持沉默，主要存在于全部的擬桿菌及共生菌的部分非免疫結(jié)構(gòu)特征中,并且證實(shí)LPS介導(dǎo)的免疫耐受是體內(nèi)共有微生物的固有特征。

2 小鼠腸道菌群對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的影響

機(jī)體黏膜表面是非自身抗原與機(jī)體相接觸的第一道關(guān)卡，其中腸道已經(jīng)發(fā)展成為獨(dú)特的淋巴器官，并且腸道免疫系統(tǒng)已被公認(rèn)為機(jī)體最大免疫器官，不僅需要肩負(fù)管理食物代謝、營養(yǎng)吸收和防御病原體的使命，還需要維持機(jī)體免疫平衡、協(xié)調(diào)機(jī)體免疫耐受，是機(jī)體行使免疫監(jiān)視的第一道防線。小鼠機(jī)體內(nèi)不同作用的腸道微生物群所啟動(dòng)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是大相徑庭的，雖然微生物調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)的機(jī)制正在深入研究之中，但目前認(rèn)為主要有兩種方式：①與宿主細(xì)胞的直接相互作用；②通過與膳食代謝物相作用或者自己產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)分子來調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，其可為腸黏膜細(xì)胞提供某些維持功能的必需成分，與機(jī)體形成互惠互利的特殊共存關(guān)系[7]。

2.1腸道菌群間接影響腸道免疫功能的調(diào)節(jié) 來自于消化道中的食物殘?jiān)?jīng)厭氧菌發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括蛋白質(zhì)、多糖和激活模式識(shí)別受體的分子，如Toll樣受體和NOD樣受體均可刺激黏膜免疫系統(tǒng)[8]，并且其產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)對(duì)于腸道免疫反應(yīng)的重要性已被證實(shí)。而結(jié)腸中食物經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵后所產(chǎn)生的主要產(chǎn)物是短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFAs)包括乙酸、丁鹽酸和丙酸，其可通過腸上皮細(xì)胞進(jìn)入并與宿主細(xì)胞相互作用，吸收后在血清中循環(huán)并影響宿主的免疫反應(yīng)和發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并可抑制具有促進(jìn)維持免疫穩(wěn)態(tài)的抗炎型細(xì)胞作用的組蛋白脫乙酰酶[1]。其中丁鹽酸作為細(xì)菌菌株特異性分子的代表，是組蛋白去乙?；傅囊种苿┘癎蛋白偶聯(lián)受體的配體，被認(rèn)為是影響宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)分子[9]。而據(jù)最近的報(bào)道又發(fā)現(xiàn)丁鹽酸對(duì)于腸道巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，故對(duì)結(jié)腸中的共生菌呈現(xiàn)低反應(yīng)性[10]。在與普通環(huán)境下的小鼠相比無菌小鼠其結(jié)腸中具有較高水平的可發(fā)酵底物及低水平的SCFAs，由此可見SCFAs主要由微生物在腸內(nèi)產(chǎn)生[11]。

2.2腸道菌群參與T細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié) 正常穩(wěn)態(tài)下腸腔內(nèi)富含大量的T細(xì)胞，并對(duì)腸道內(nèi)不同的抗原進(jìn)行識(shí)別、清除及形成相應(yīng)的耐受，一旦小鼠腸道菌群失調(diào)后不僅多數(shù)細(xì)胞因子例如IL-7、IL-10、IL-22及IFN-g會(huì)發(fā)生變化[12]，同時(shí)T細(xì)胞中的Th1、Th17、Treg也會(huì)出現(xiàn)明顯減少[13]。但當(dāng)無菌小鼠腸道內(nèi)給予部分定植細(xì)菌后，細(xì)胞因子的產(chǎn)生又恢復(fù)到正常水平，并且Th1和Th17細(xì)胞數(shù)目也明顯增加，由此可知腸道中T細(xì)胞正常功能的維持依賴于共生菌群的存在[14]。同時(shí)Ivanov團(tuán)隊(duì)[12]發(fā)現(xiàn)小腸固有層中Th17細(xì)胞分化需要特定的共生微生物群。其中與腸道中的黃桿菌、擬桿菌存在密切的相關(guān)，雖然獨(dú)立于TLR、IL-21或IL-23的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但卻需要適當(dāng)?shù)腡GF-β活化。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)腸道菌群可調(diào)節(jié)小腸固有層中Foxp3+Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的平衡，腸道微生物群的組成便成了此協(xié)調(diào)作用的關(guān)鍵點(diǎn)[7]。并且通過對(duì)無菌小鼠的研究后發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)量也明顯減少[15]。故腸道菌群的減少甚至是消失對(duì)于腸道中主要調(diào)控免疫耐受功能的Treg細(xì)胞存在重要影響。但Cording團(tuán)隊(duì)[16]通過長期使用抗生素消耗掉腸道中菌群后發(fā)現(xiàn)，小鼠機(jī)體中CD4+T細(xì)胞的增殖呈全身性減少，但Foxp3+Treg的增殖僅在腸道中的MLN和PPs中受損。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)于小鼠T細(xì)胞的免疫功能還具有免疫佐劑功能。腸道中的共生菌有富含非甲基化核苷酸受體序列的寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)，而CpG-ODN已具有與CD28相似的共同刺激T細(xì)胞活化的功能。并且CpGA類還具有誘導(dǎo)PDC產(chǎn)生INF-α，誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ，誘導(dǎo)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓臉渫粻罴?xì)胞的作用，同時(shí)CpG-ODN對(duì)T細(xì)胞的固有特性可能有助于微生物DNA和CpG-ODN對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的佐劑效力[17]。同時(shí)作為腸道菌群與食物殘?jiān)嗷プ饔煤笏a(chǎn)生的丁鹽酸也可參與Treg細(xì)胞的調(diào)控能力，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在丁鹽酸參與的初始CD4+T分化為Treg中，作為Foxp3啟動(dòng)子的組蛋白3賴氨酸27乙?；娇稍龈撸瑫r(shí)非編碼保守序列1、非編碼保守序列2的增強(qiáng)子水平也可提高，從而發(fā)現(xiàn)Foxp3的誘導(dǎo)能力和Treg的調(diào)節(jié)能力均明顯提升[18]?？梢姛o論是腸道菌群的直接作用或是間接作用，它們的存在對(duì)于小鼠腸道中及體內(nèi)T細(xì)胞功能的調(diào)控都起了關(guān)鍵性的作用。

2.3腸道菌群參與B細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié) 在腸道PPs中含有大量B細(xì)胞的生發(fā)中心，作為腸道免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)細(xì)胞，腸道菌群的改變對(duì)PPs的免疫功能也產(chǎn)生了一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)在無菌小鼠體內(nèi)腸黏膜免疫力不足，動(dòng)物呈現(xiàn)較小的腸系膜淋巴結(jié)，PPs的發(fā)育不良，并且具有分泌IgA功能的漿細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，對(duì)抗病原菌的能力也明顯減弱[19]，但將普通小鼠的腸道菌群移植給無菌小鼠后，此種狀態(tài)即被逆轉(zhuǎn)[20]。腸道菌群原核DNA的非甲基化核苷酸受體B類(CpG-B)可誘導(dǎo)體內(nèi)共刺激分子和TNF-α產(chǎn)生并表達(dá)PDC，并且可上調(diào)B細(xì)胞的活化標(biāo)志物和IL-6的表達(dá)量[21]。并且凋亡碎片所產(chǎn)生的非甲基化核苷酸受體還可以激活TLR9，特別是在它們被轉(zhuǎn)化為自身抗體的免疫復(fù)合物的情況下，然后通過TLR9和B細(xì)胞受體進(jìn)一步刺激B細(xì)胞，從而引起自身免疫性疾病的發(fā)生[22]。同時(shí)腸道菌群還可誘導(dǎo)腸道PPs中B細(xì)胞生發(fā)中心的短暫擴(kuò)張，促進(jìn)PPs中的B細(xì)胞發(fā)育，由于B細(xì)胞是分泌型IgA(SIgA)及部分免疫球蛋白E(IgE)的前體細(xì)胞，故B細(xì)胞的增多可進(jìn)一步促進(jìn)相關(guān)Ig的生成。正常小鼠出生后即具備形成SIgA 應(yīng)答能力，6周時(shí)IgA分泌細(xì)胞數(shù)量才能達(dá)到成年小鼠水平，而IgA分泌延遲的關(guān)鍵源于小鼠從出生至斷乳期，不同喂養(yǎng)順序所建立的腸道菌群經(jīng)刺激過程。并且Myunghoo團(tuán)隊(duì)[23]最近證實(shí)腸道菌群參與產(chǎn)生的SCFAs，不僅具有刺激宿主抗體反應(yīng)性的作用，還具有加快細(xì)胞代謝，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)B細(xì)胞向抗體生成細(xì)胞分化的能力，結(jié)果進(jìn)一步揭示了微生物代謝物在調(diào)節(jié)宿主抗體反應(yīng)中的重要性。

2.4腸道菌群參與口服耐受的調(diào)節(jié) 早在20年前口服耐受就開始受到人類的關(guān)注，而最近一些觀點(diǎn)也反復(fù)支持即環(huán)境因素(例如抗生素，飲食，接種疫苗)改變?cè)谶^敏性致敏的調(diào)節(jié)中起重要作用[24]。Andrew[25]團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)無菌小鼠及抗生素處理過的小鼠對(duì)食物過敏原的致敏力增強(qiáng)，無法形成有效的口服耐受，之后通過對(duì)無菌小鼠進(jìn)行菌群移植，并運(yùn)用基因分析技術(shù)對(duì)無菌小鼠腸上皮進(jìn)行檢測(cè)分析，他們發(fā)現(xiàn)了梭狀芽胞桿菌調(diào)節(jié)先天性淋巴細(xì)胞功能和腸上皮通透性從而保護(hù)腸道過敏源致敏的新機(jī)制，從而論證含有梭菌的微生物群在保護(hù)腸道對(duì)食物產(chǎn)生過敏的免疫反應(yīng)中起重要作用。在口服耐受中具有重要調(diào)節(jié)作用的Treg細(xì)胞，特別是經(jīng)由食物抗原產(chǎn)生的Treg，不僅在腸道形成并定植并且在全身循環(huán)中也被發(fā)現(xiàn)，其在維持系統(tǒng)性免疫耐受中也起重要作用[26]。Kim團(tuán)隊(duì)[27]發(fā)現(xiàn)將流質(zhì)飲食喂養(yǎng)給無菌小鼠后，其小腸中由食物抗原誘發(fā)的Treg細(xì)胞在黏膜固有層增殖和增多，而微生物群則在結(jié)腸中誘發(fā)由外周誘導(dǎo)而產(chǎn)生的Treg(pTreg)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸中經(jīng)微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生的表型為RORγt 1的pTreg細(xì)胞，與經(jīng)食物抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的pTreg細(xì)胞在表型和功能上出現(xiàn)了明顯的差異，并且表型為RORγt 1的pTreg細(xì)胞其壽命不僅明顯大于pTreg細(xì)胞，其在協(xié)調(diào)機(jī)體免疫耐受中也起重要作用。同時(shí)Rask團(tuán)隊(duì)[28]的研究發(fā)現(xiàn)，給予單一定植菌的悉生(gnotobiotic)小鼠或無菌小鼠與普通小鼠比較，后者能通過上調(diào)小腸黏膜上皮主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)的表達(dá)，誘導(dǎo)OVA的口服耐受；而單一定植菌的悉生小鼠或無菌小鼠則不能，由此可知口服耐受的誘導(dǎo)和形成不僅需要腸道菌群的配合，還需要多種腸道菌群的協(xié)同作用才可完成。并且盡早建立腸道共生菌群，及保持腸道菌群的長期穩(wěn)態(tài)平衡，才能促使小鼠腸道的口服耐受更加完善。

3 小鼠腸道菌群對(duì)脾臟的影響

早期的研究就發(fā)現(xiàn)居住環(huán)境的影響導(dǎo)致腸道殖民菌群的不同，最終對(duì)小鼠脾臟的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了影響，例如與生長在正常環(huán)境中的小鼠相比，無菌小鼠血清中IgG的分泌量明顯下降，同時(shí)脾臟和淋巴結(jié)中B細(xì)胞區(qū)域和T細(xì)胞區(qū)域的結(jié)構(gòu)是混亂的[29]，其中脾臟中B細(xì)胞的生發(fā)中心不僅少而且小，進(jìn)而影響B(tài)細(xì)胞的分化和成熟[30]。Arya團(tuán)隊(duì)[31]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無菌小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物F4/80hi和巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞組成的多樣性群體標(biāo)志物F4/80lo細(xì)胞的比例和總數(shù)均減少，他們發(fā)現(xiàn)無菌小鼠脾臟中的多樣性群體均減少，而用抗生素治療SPF小鼠后也會(huì)導(dǎo)致脾臟中的骨髓細(xì)胞群減少，由此可推論腸道菌群可動(dòng)態(tài)地影響外周免疫器官的先天免疫細(xì)胞比例，故可進(jìn)一步認(rèn)為腸道菌群在機(jī)體免疫細(xì)胞的初級(jí)發(fā)育階段中占有重要的位置。并且腸道菌群不僅具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能性，在維持外周循環(huán)中的中性粒細(xì)胞數(shù)量和脾臟中的CD4+T細(xì)胞功能上均起了重要的作用[32]。由此可見腸道菌群的存在不僅只對(duì)胃腸道的免疫細(xì)胞產(chǎn)生影響，對(duì)于機(jī)體遠(yuǎn)處免疫器官的發(fā)育、發(fā)展也有明顯影響。

目前科學(xué)家外對(duì)腸道菌群與腸黏膜免疫相互作用的調(diào)控機(jī)制研究已逐步深入，通過對(duì)各個(gè)靶點(diǎn)及關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)的研究，研究人員已發(fā)現(xiàn)許多因腸道菌群穩(wěn)態(tài)改變而引起的免疫性疾病及腫瘤發(fā)生的原因。相信隨著對(duì)腸道菌群與機(jī)體之間協(xié)同作用的進(jìn)一步探究，將幫助人類發(fā)現(xiàn)更多疾病的發(fā)病機(jī)制，并對(duì)相關(guān)疾病的治療提供新證據(jù)及思路。

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