細(xì)胞焦亡的研究進(jìn)展

王星星，宋虎，杜晨陽(yáng) ，王振，張建軍△

細(xì)胞焦亡最初被描述為鼠傷寒沙門氏菌感染的巨噬細(xì)胞的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）-1依賴性細(xì)胞死亡，在體外［1］和體內(nèi)均可發(fā)生［2］。1992年，Zychlinsky等［3］在志賀菌感染的巨噬細(xì)胞中觀察到細(xì)胞死亡的裂解形式。這種細(xì)胞死亡最初被稱為細(xì)胞凋亡，因?yàn)槠渑c細(xì)胞凋亡具有某些共同特征，包括DNA片段化、核凝聚和caspase依賴性。后來(lái)，隨著caspase-1依賴性細(xì)胞死亡的進(jìn)一步表征，發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞凋亡不同。因此，在2001年，caspase-1依賴性細(xì)胞死亡被命名為細(xì)胞焦亡［4］。

1 細(xì)胞焦亡的機(jī)制和特點(diǎn)

細(xì)胞死亡程序包括凋亡、自噬、壞死以及焦亡。在形態(tài)學(xué)和病理生理學(xué)上，細(xì)胞焦亡與其他形式的細(xì)胞程序性死亡不同。如細(xì)胞凋亡通常伴隨著細(xì)胞核固縮、核凝聚和核碎裂，以及通過(guò)形成凋亡小體（其在體內(nèi)被駐留的吞噬細(xì)胞吞噬）。其特征在于細(xì)胞自主分解的活躍程序化過(guò)程，不會(huì)將細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，且可有效抑制炎癥。而細(xì)胞焦亡的特征在于快速的質(zhì)膜破裂［5］，隨后釋放細(xì)胞內(nèi)容物和促炎介質(zhì)，包括白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18和高遷移率族蛋白（HMGB）-1。它們對(duì)免疫應(yīng)答反應(yīng)有很多影響，包括促炎因子的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)及T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌IFN-γ的作用增強(qiáng)。細(xì)胞焦亡是伴隨著大量炎性因子產(chǎn)生的特殊程序性死亡［6］。有研究表明，細(xì)胞凋亡依賴caspase-3和caspase-6，而細(xì)胞焦亡是主要依賴于人、鼠caspase-1（或鼠caspase-11）為介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑［7-9］。caspase-1不參與凋亡性細(xì)胞死亡，caspase-1缺陷型細(xì)胞對(duì)大多數(shù)凋亡信號(hào)正常反應(yīng)［10］。caspase-1的一個(gè)重要功能是活化IL-1β和IL-18［11］。感染傷寒沙門菌或志賀菌的巨噬細(xì)胞中存在caspase-1活化，導(dǎo)致這些細(xì)胞因子的激活和宿主細(xì)胞的死亡［12-13］。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，通過(guò)激活caspase活化的DNA酶（CAD）和降解CAD抑制劑（ICAD）發(fā)生核內(nèi)DNA切割［14］。更重要的是，凋亡細(xì)胞中的線粒體外膜釋放大量凋亡因子（apoptogenic）到細(xì)胞質(zhì)中，包括細(xì)胞色素C和線粒體蛋白質(zhì)（Smac/DIABLO）［15］。然而，在細(xì)胞焦亡過(guò)程中不會(huì)發(fā)生DNA梯度斷裂和ICAD降解［16-17］。細(xì)胞焦亡是感染后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的caspase-1依賴性細(xì)胞死亡，伴隨著質(zhì)膜通透性改變和核凝聚的炎癥反應(yīng)［6，9，18］。在巨噬細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中，傷寒沙門菌通過(guò)活化依賴于caspase-1誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，促進(jìn)IL-1β［8，18］的活化和分泌。由傷寒沙門菌感染的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子在腸組織中引起強(qiáng)烈的炎癥，由此可見，這種形式的細(xì)胞死亡的機(jī)制和結(jié)果明顯不同于凋亡。

2 細(xì)胞焦亡的炎癥通路

研究表明，人和鼠細(xì)胞焦亡均存在兩種途徑，細(xì)胞受到的刺激不同，所誘發(fā)的途徑也不同，包括介導(dǎo)caspase-1活化的經(jīng)典炎性小體和促進(jìn)小鼠caspase-11活化和人類caspase-4和caspase-5活化的非經(jīng)典炎性小體。在人類細(xì)胞中，caspase-4和caspase-5表現(xiàn)出與鼠caspase-11相同的功能［7］。介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的炎癥性caspase可被炎性小體激活［19］。caspase-1被各種經(jīng)典炎癥小體的配體激活，caspase-4，caspase-5和caspase-11直接識(shí)別細(xì)菌脂多糖，兩者都引發(fā)細(xì)胞焦亡。

2.1 細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路 細(xì)胞中的caspase-1以無(wú)活性的酶原形式存在，可通過(guò)與炎性小體結(jié)合而被激活，激活后形成具有酶活性的異二聚體，促進(jìn)炎性因子成熟并釋放。細(xì)胞焦亡在炎性巨噬細(xì)胞的質(zhì)膜中迅速形成直徑12～14 nm的孔［20］，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)溶脹和通過(guò)破裂滲透裂解質(zhì)膜［21］，這些孔的形成需要caspase-1活化以及宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排。caspase-1活化是通過(guò)炎性體誘導(dǎo)驅(qū)動(dòng)的，促進(jìn)蛋白水解成熟以及炎性細(xì)胞因子IL-18和IL-1β的活化和分泌，并裂解gasdermin D（GSDMD）以誘導(dǎo)孔開放［22-23］。IL-1β和IL-18在炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［24-25］。盡管細(xì)胞死亡過(guò)程中沒(méi)有細(xì)胞因子的參與，但細(xì)胞因子的產(chǎn)生有助于細(xì)胞焦亡后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)［13，26］。質(zhì)膜中caspase-1依賴性孔的形成與巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞因子釋放在時(shí)間上相關(guān)，表明細(xì)胞因子分泌通過(guò)這些孔發(fā)生［17］。

炎性小體是多種蛋白質(zhì)信號(hào)復(fù)合物，其中心支架包括炎性小體 NLRP1、NLRP3、NAIP-NLRC4、AIM2和Pyrin［27］。每個(gè)炎性小體包含介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)事件的caspase激活和募集域（CARD）或熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）。那些只有PYD的專用信號(hào)通過(guò)由PYD和CARD組成的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）適配器傳遞。ASC的CARD域通過(guò)CARD-CARD相互作用募集caspase-1，具有CARD結(jié)構(gòu)域的信息傳遞組（NLRC4，NLRP1，NLRP1a，NLRP1b）可以通過(guò) ASC或直接傳遞給caspase-1。對(duì)于含有CARD的炎性小體，細(xì)胞焦亡涉及ASC和caspase-1作用。與其他炎癥引發(fā)傳感器不同，NLRC4不具有N-末端的pyrin結(jié)構(gòu)域，并且直接結(jié)合Ⅲ型細(xì)菌分泌系統(tǒng)的內(nèi)部桿、鞭毛蛋白或針狀蛋白，然后激活伴隨IL-1β分泌的pyroptosis。豐富的IL-1β會(huì)增加ASC斑點(diǎn)的形成，并與輔助因子協(xié)同作用，促進(jìn)模式識(shí)別，從而協(xié)助NLRC4信號(hào)傳導(dǎo)［28-29］。

2.2 細(xì)胞焦亡非經(jīng)典通路 caspase-11、caspase-4和caspase-5是非經(jīng)典型炎性小體的關(guān)鍵組成部分，然而，其全部構(gòu)成還不清楚。caspase-11、caspase-4和caspase-5通過(guò)直接與細(xì)菌脂多糖（LPS）結(jié)合被激活［30］。激活之前，必須通過(guò)Ⅰ型IFN或IFN-γ［31］啟動(dòng)caspase-11。LPS的脂質(zhì)部分與相關(guān)caspase的CARD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合促進(jìn)了它們的寡聚化和活化。據(jù)研究，caspase-11可通過(guò)不依賴于傳統(tǒng)LPS、Toll樣受體4（TLR4）的機(jī)制直接介導(dǎo)細(xì)胞死亡和IL-1α分泌［28］。同時(shí) caspase-11 也可通過(guò) NLRP3-ASC-caspase-1途徑間接處理IL-1β，而使caspase-11缺陷的小鼠免受內(nèi)毒素性休克。此外，caspase-11的表達(dá)可以誘導(dǎo)其自身激活，激活的caspase-11可以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，這對(duì)于通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌空泡與溶酶體融合來(lái)限制細(xì)胞內(nèi)病原體（如嗜肺軍團(tuán)菌）的生長(zhǎng)可能有重要作用。

caspase-11誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與胞質(zhì)內(nèi)細(xì)菌病原體的清除有關(guān)［32］。當(dāng)LPS或IFN-γ處理巨噬細(xì)胞時(shí)，它們?cè)诒廾鞍兹毕萃蛔冃褪确诬妶F(tuán)菌感染期間迅速經(jīng)歷caspase-11依賴性細(xì)胞焦亡［33］。然而，野生型嗜肺軍團(tuán)菌在體外感染用LPS預(yù)處理的巨噬細(xì)胞時(shí)可誘導(dǎo)caspase-11依賴性的細(xì)胞焦亡，可能是因?yàn)榧?xì)菌局限于結(jié)構(gòu)完整的穩(wěn)定液泡并且不進(jìn)入胞質(zhì)溶膠所致。與caspase-1相似，對(duì)caspase-11功能的研究集中在巨噬細(xì)胞上。Lagrange等［30］證明，caspase-4檢測(cè)人單核細(xì)胞中的LPS是組成性表達(dá)。這與髓樣細(xì)胞中誘導(dǎo)的caspase-11相反，表明在人類中LPS介導(dǎo)的內(nèi)毒素性休克不需要啟動(dòng)步驟。此外，caspase-4在角質(zhì)形成細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，但在T細(xì)胞或前髓樣細(xì)胞中不表達(dá)［30］。caspase-5 也能結(jié)合 LPS，并能重新形成caspase-11缺陷型的骨髓性巨噬細(xì)胞（bone marrow-deivedmaerophages，BMMs）焦 亡 ，但caspase-5在巨噬細(xì)胞中不表達(dá)。

3 細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制

3.1 炎性小體及因子 目前已知的炎性小體是一種多聚蛋白復(fù)合物，包含在3個(gè)基因家族中：Nod樣受體（NLR）、AIM2樣受體（ALR）以及新鑒定的Pyrin炎性小體［34］。其中 NLRP1、NLRP3、NLRC4 炎性小體最為人熟知。NLR在識(shí)別引入宿主細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的危險(xiǎn)信號(hào)中發(fā)揮作用；TLR啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞激活和產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子（TNF）、IL-6、IL-8和Ⅰ型IFN信號(hào)。NLR的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域的NOD1和NOD2在配體識(shí)別后引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，類似于由TLR引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生［35］。TLRs和caspase-1活化NLR通常與TLR刺激協(xié)同作用，導(dǎo)致對(duì)ATP治療和耶爾森菌感染反應(yīng)中NLR介導(dǎo)的caspase-1激活易感性增強(qiáng)。AIM2是一種主要定位于胞漿的蛋白質(zhì)，其N端含有PYD，C端是寡聚核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。當(dāng)雙鏈DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)后，AIM2可通過(guò)寡聚核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與雙鏈DNA直接結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合，緊接著AIM2的PYD與ASC的PYD相互作用，誘導(dǎo)ASC的二聚體化以及炎性小體的組裝，ASC再通過(guò)自身CARD招募caspase-1，從而激發(fā)先天性免疫反應(yīng)。

3.2 caspase家族 盡管caspase家族的所有成員在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上有相似之處，但它們的生理作用差異顯著。caspases在觸發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡中發(fā)揮核心作用，但不參與其他程序性細(xì)胞死亡?？筛鶕?jù)其生理作用和底物特異性對(duì)caspase家族成員進(jìn)行分類，它們分為兩大類：凋亡相關(guān)的蛋白（caspase-2/3/6/7/8/9/10），與caspase-1相關(guān)的蛋白（caspase-5/13/14）以及鼠與焦亡相關(guān)蛋白人鼠共有caspase-1（人類caspase-4/5及鼠類caspase-11/12）。凋亡啟動(dòng)蛋白（caspase-2/8/9/10）作為起始caspase主要負(fù)責(zé)啟動(dòng)半胱天冬酶活化級(jí)聯(lián)。效應(yīng)蛋白酶（caspase-3/6/7）通過(guò)切割細(xì)胞底物來(lái)參與細(xì)胞凋亡。凋亡啟動(dòng)蛋白的激活需要二聚化，其主要由caspase募集結(jié)構(gòu)域或死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基序結(jié)合蛋白分子介導(dǎo)［36］。激活后，caspase-2/8/9/10通過(guò)級(jí)聯(lián)方式活化下游效應(yīng)蛋白酶來(lái)引發(fā)死亡信號(hào)［37］。效應(yīng)蛋白酶通過(guò)內(nèi)部Asp殘基的蛋白水解轉(zhuǎn)化為活性形式，形成由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成的活性異源四聚體［36］。caspase-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的IL-1β轉(zhuǎn)換酶，被認(rèn)為是炎癥和細(xì)胞死亡途徑的主要參與者。

3.3 GSDMD Lagrange 等［30］將 GSDMD 鑒 定 為caspase-1和caspase-4/5/11的通用底物。caspase切割GSDMD底物是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵執(zhí)行事件［30］。Gasdermin是二聯(lián)蛋白，其N-和C-末端結(jié)構(gòu)域通過(guò)接頭連接，并且在免疫相關(guān)疾病中具有重要的作用［38］。caspases-1或caspases-11裂解GSDMD，并釋放N-末端結(jié)構(gòu)域，然后與質(zhì)膜的內(nèi)部小葉結(jié)合并寡聚形成膜孔。這些孔隙的直徑范圍為12～14 nm，為IL-1β（4.5 nm）分泌到細(xì)胞外的重要途徑。膜孔數(shù)量少時(shí)，IL-1β通過(guò)這些孔逸出量隨之減少，少量的鈉和水進(jìn)入，此時(shí)輕度腫脹的細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)體積減少機(jī)制來(lái)抵消，防止膜破裂，稍后細(xì)胞可以通過(guò)正常的膜修復(fù)過(guò)程去除孔［39］。相反，當(dāng)膜孔形成數(shù)量增多，細(xì)胞顯著腫脹導(dǎo)致膜破裂，稱之為細(xì)胞焦亡，并且從胞質(zhì)溶膠中釋放所有剩余的經(jīng)過(guò)加工的IL-1β。GSDME是gasdermin家族的另一成員，最近的研究發(fā)現(xiàn)在GSDME高表達(dá)的化療治療細(xì)胞中表現(xiàn)出與GSDMD在孔形成過(guò)程中相同的功能，并將凋亡轉(zhuǎn)換為細(xì)胞焦亡，該蛋白在腫瘤化療藥物的作用下，通過(guò)caspase-3的切割作用獲得活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞焦亡，并在化療藥物對(duì)正常組織的不良反應(yīng)中扮演重要角色［40］。進(jìn)一步了解GSDMD的作用機(jī)制可能為炎癥性半胱天冬酶相關(guān)的自身炎癥性疾病和感染性休克的治療提供新的途徑。

4 細(xì)胞焦亡在疾病中的發(fā)生發(fā)展

越來(lái)越多的證據(jù)表明細(xì)胞焦亡在免疫和疾病中起著重要的作用。細(xì)胞焦亡在感染過(guò)程中促進(jìn)損傷細(xì)胞的死亡［41］，此外，還通過(guò)充當(dāng)免疫細(xì)胞募集到感染部位的警報(bào)信號(hào)來(lái)促進(jìn)病原體清除，進(jìn)而有效保護(hù)機(jī)體。細(xì)胞焦亡可防止感染并誘發(fā)病理性炎癥。一方面炎性小體可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；另一方面，炎性小體的累積效應(yīng)也可以形成適宜腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，起著促瘤生長(zhǎng)的作用。因此，細(xì)胞焦亡在某種程度上是一把雙刃劍。一方面，中度細(xì)胞焦亡有助于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并可有效地防止過(guò)度細(xì)胞增殖，這可能會(huì)保護(hù)宿主；另一方面，高水平的細(xì)胞焦亡可導(dǎo)致炎癥，這不利于維持體內(nèi)平衡。另有更多證據(jù)表明，在感染期間，細(xì)胞焦亡可以作為宿主有效的抗菌防御。

雖然caspase-1激活和細(xì)胞焦亡可以作為對(duì)感染性疾病的保護(hù)性宿主反應(yīng)，但過(guò)表達(dá)或不適當(dāng)?shù)腸aspase-1激活和細(xì)胞焦亡可能是有害的。NLR蛋白的突變可導(dǎo)致不合適的caspase-1活化，其與遺傳性自身炎癥綜合征相關(guān)［42］。此外，caspase-1參與包括心肌梗死、腦缺血、炎癥性腸病、神經(jīng)退行性疾病和內(nèi)毒素性休克在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制，其中每一種疾病的共同特征在于炎癥和細(xì)胞死亡。caspase-1缺陷或藥理學(xué)抑制提供對(duì)與這些疾病相關(guān)的炎癥、細(xì)胞死亡和器官功能障礙的保護(hù)，使得caspase-1成為有吸引力的治療靶標(biāo)。

細(xì)胞焦亡與各種感染性疾病關(guān)系密切。志賀桿菌、李斯特桿菌、綠膿桿菌、弗朗西斯菌屬、嗜肺性軍團(tuán)桿菌以及耶爾森桿菌均被證實(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡。caspase-1依賴的細(xì)胞死亡方式不僅存在于單核巨噬細(xì)胞系，還存在于樹突狀細(xì)胞等其他細(xì)胞中。誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生caspase-1依賴細(xì)胞死亡的刺激原也不僅局限于病原體，一些非生物性的刺激源，如損傷相關(guān)模式分子（DAMP）、缺血壞死的產(chǎn)物等也可誘導(dǎo)細(xì)胞caspase-1依賴的細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展，并發(fā)揮重要作用。對(duì)細(xì)胞焦亡的深入研究有助于認(rèn)識(shí)其在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用，為臨床防治提供新思路。